质谱的质量精度是衡量质谱定性能力的一个重要指标，当前常见的高分辨质谱系统（TOF、Orbitrap）的质量精度为通常在1-5ppm之间，但我们很难通过测定的精确质量数得到未知物的唯一分子式，特别是对于m/z > 400的化合物。

如图1所示，即使质量精度达到FT-MS的0.1 ppm以内，随着分子量的增大，分子式的可能性越来越多。因此，仅靠质谱的高质量精度，往往并不能确定一个唯一的分子式，尤其是当要考虑到更多的元素种类时。

图1：不同质量精度下的元素组成个数

（数据来源：Tobias Kind and Oliver Fiehn, BMC Bioinformatics 2006, 7:234）

质谱上测定一个化合物时得到的信息不只是单同位素峰的精确质量，还包括了它的重同位素峰及其相对分布。Tobias Kind和Oliver Fiehn在2006年的文章中已经证明了同位素比例结合精确质量数在减少可能的元素组成方面比单纯依靠更高的分辨率和质量精度更占优势。在下文中，我们将在高分辨率(TOF或Orbitrap)和传统的单或三重四极质谱系统上进行实验，介绍和质量精度和同位素谱图准确度（Spectral Accuracy）相结合对未知物分子式鉴定的作用。

　　四极杆质谱上的未知物的分子式测定

　　在MassWorks软件中借助TrueCal™校正技术，可以将四极杆质谱的质量精度提高100倍以上，将质量精度从0.x提升至0.00x的质量精度。结合在校正过程获得的无与伦比的谱图准确度（Spectral Accuracy），通过CLIPS检索分析，就可以在四极杆GC/MS或LC/MS上来获得鉴定未知化合物的分子式的能力。我们对LC/MS测定的C25H23N2OS+进行了分析，MassWorks软件测定的精确质量数m/z = 399.1448，图2显示CLIPS检索分析的条件，设定可能元素组成为C、H、N、O、S，检索的质量误差为 ±20mDa。

图2：CLIPS检索条件

　　图3显示了CLIPS检索分析的结果，列表中一共有126个可能的候选分子式。当我们用同位素的谱图准确度（Spectral Accuracy）进行排序时，谱图准确度≥98.5%的候选分子式只有5个，正确的分子式C25H23N2OS被准确地显示在了列表中的第1位。

图3：C25H23N2OS的CLIPS分子式检索结果（按谱图准确度从高至低排序）

正确分子式C25H23N2OS的谱图准确度为99.1%，图4（上）显示了其理论谱图和校正谱图的对比，两者完美重合。图4（下）显示了排名第1、5、6位分子式的理论谱图的对比，可以看到，由于C原子个数的不同，在重同位素A+1处，存在明显的丰度差异，谱图准确度越高，分子式正确的可能越高。因此谱图准确度是帮我们识别正确分子式的一个重要指标。

　　图4：（上）校正谱图与排序第一的分子式的理论同位素分布比较；（下）排序1、5、6位分子式的理论同位素分布比较

如果只考虑质量精度，我们需要达到多少的精度才能帮助我们去找到目标分子式呢？我们假设了理论的精确质量为实测值，重新进行了CLIPS分子式检索，并将分子式的排序设定为按质量误差排序，结果见图5。在得到的119个待选结果中，至少需要质量精度优于1.5ppm才能在前5个候选分子式中找到正确的分子式。

　　图5：C25H23N2OS的分子式检索结果（按质量误差从小到大排序）

　　高分辨质谱TOF的未知物的分子式测定

　　在MassWorks软件中通过sCLIPS检索分析，可以对TOF数据进行全面的峰形校正以获得高的谱图准确度。图6显示了C43H74NO15的质谱图校正前后的对比。

图6：化合物C43H74NO15的TOF数据校正前后的比较

图7为sCLIPS检索分析时设定的检索参数，设定可能元素组成为C、H、N、O、S，检索的质量误差为 ±5ppm。

　　图7：sCLIPS检索条件

　　图8显示了sCLIPS检索分析的结果，列表中一共有63个可能的候选分子式。当我们用同位素的谱图准确度（Spectral Accuracy）进行排序时，分别只有3个或2个候选分子式的谱图准确度≥98%或98.5%，正确的分子式C43H74NO15被准确地显示在了列表中的第1位。

图8：C43H74NO15的sCLIPS分子式检索结果（按谱图准确度从高至低排序）

　　正确分子式C43H74NO15的谱图准确度为98.97%，图9（上）显示了其理论谱图和校正谱图的对比，两者完美重合。图9（下）显示了排名第1、3、4位分子式的理论谱图的对比，可以看出排序第4的分子式的同位素分布的误差明显大于前两个分子式，因此在实际的验证分析中，我们只需要考察前三个分子式。

图9：（上）校正谱图与排序第一的分子式的理论同位素分布比较；（下）排序1、3、4位分子式的理论同位素分布比较

　　既然通过谱图准确度能帮我们准确地将分子式锁定在前3位，那如果只考虑质量精度，我们的TOF需要达到多少的精度才能帮助我们去找到目标分子式呢？我们假设了理论的精确质量为实测值，重新进行了sCLIPS分子式检索，并将分子式的排序设定为按质量误差排序，结果见图10。在得到的候选结果中，需要具有高于0.2ppm或0.02ppm的非常高的质量精度，才能分别在前3个或前2个候选元素中找到正确的元素组成。

图10：C43H74NO15的分子式检索结果（按质量误差从小到大排序）

　　 结论 

　　1）四极杆质谱上：[20mDa质量精度+98.5%谱图准确度精度]=1.5ppm

20mDa (50ppm @ 400Da)的质量误差与98.5%的谱图准确度相结合，通过TrueCal可以在大多数单、三重四极杆质谱系统上实现，等同于1.5ppm的质量精度的分子式鉴定效果，且正确的分子式排在前5位，这相当于TOF的未知物鉴定水平。

2）高分辨质谱上：[5ppm质量精度+98.0%谱图准确度]=0.2ppm

5ppm的质量精度(@845Da)结合98.0%的谱图准确度，可以在高分辨质谱系统上实现等同于0.2ppm质量精度的分子式鉴定效果，且正确的元素组成排在前3位。3）在未知物的鉴定分析中，无需过分地追求更优的质量精度，更好的质量精度意味着更高的硬件投入成本；而是应该考虑质量精度+谱图准确度的组合，在现有的质谱系统上，通过谱图准确度来提升质谱系统的未知物鉴定潜力。如四极杆质谱+MassWorks软件来达到TOF的未知物定性效果。

关于MassWorks

　　软件MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　关于绿绵科技

绿绵科技是Cerno Bioscience公司在中国区的总代理商，负责Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等产品市场推广、销售、售前/售后技术支持、应用支持。若您想了解获取 MassWorks 产品的更多信息或应用，欢迎致电绿绵科技！