H.E.L 生物合成研究：细菌的气体培养--BioXplorer 生物反应器应用案例

前言

合成生物学（Synthetic Biology）是一门新兴的跨学科领域，它结合了生物学、工程学、计算机科学、化学、物理学以及遗传学等多个学科的知识和技术。合成生物学在生物制造领域的应用是其最引人注目的方面之一。生物制造，也称为生物加工或生物生产，是指利用生物体（如细菌、酵母、真菌、植物或动物细胞）来生产化学品、燃料、材料和药物的过程。

合成生物学在生物制造领域的优势包括：

可持续性：生物制造过程通常使用可再生资源，如糖、淀粉或纤维素，而不是依赖于有限的化石燃料。

环境友好：生物过程往往产生较少的有害废物和副产品，有助于减少环境污染。

成本效益：随着技术的进步，生物制造过程可能会变得更加经济高效，因为它们可以减少能源消耗和原材料成本。

正是由于生物合成有诸多的优势，现在引起了人们的极大兴趣。

案例：通过CO2、H2和O2高密度培养真养产碱杆菌生产聚（D-3-羟基丁酸盐）的研究

背景：微生物聚酯由于其在工业生产生物可降解塑料中的潜在应用，最近引起了相当大的关注和兴趣。现在已经发现许多细菌菌株具有在细胞内积累聚羟基烷酸（PHAs）的能力。在PHA产生细菌中，真养产碱杆菌Alcaligenes eutrophus是研究得最透彻且在PHAs研究中最广泛使用的菌株。这种微生物最初被分离为一种氢氧化细菌，能够利用二氧化碳、氧气和氢气作为底物自养生长，并在氧气和或营养限制的培养条件下在细胞内积累聚-D-3-羟基丁酸（P(3HB)）。因此，利用能够同化二氧化碳的Alcaligenes eutrophus生产可生物降解塑料，在很大程度上有助于解决两个环境污染问题：（i）大气中二氧化碳水平的增加，以及（ii）不可生物降解塑料废物的处理。然而，在大规模和经济地应用Alcaligenes eutrophus的自养培养之前，需要克服相当大的技术挑战。其中，特别是随着培养容器中底物气体的耗尽，利用效率的损失问题，以及可能发生的严重气体爆炸的潜在风险，需要特别处理。

研究方法：在自养培养过程中，需要消除气体爆炸的可能性。研究者开发了一个带有安全特性的闭路循环培养系统，通过维持底物气体相中的氧气浓度低于气体爆炸下限（6.9%）来实现安全培养。使用了一个带有篮子式搅拌器的培养容器，这种搅拌器的设计使得KLa（氧传递系数）达到了2970h-1。此外，氧气气体也直接从其他气体中分离出来，单独供给发酵器。

结论：在氧气限制条件下，经过40小时的培养，获得了91.3 g.dm-3的细胞和61.9 g.dm-3的P(3HB)。这些结果与通过异养发酵大规模生产P(3HB)的报道结果相比具有优势。特别设计的篮子式搅拌器在提高KLa值方面发挥了关键作用，这对于在低氧浓度下维持高细胞密度和P(3HB)生产至关重要。

产品应用

生物合成：Alcaligenes eutrophus细菌培养以生产聚(D-3-羟基丁酸)（P(3HB)）的详细步骤：

• 培养准备：

使用Alcaligenes eutrophus ATCC 17697菌株。准备矿物质培养基用于预培养和主培养。

• 种子培养：

在实验室规模的循环气体封闭回路培养系统中，使用200 cm³规模的罐式发酵器进行种子培养。

• 主培养：

将100ml种子培养液用于在实验工厂规模的培养系统中进行主培养。

• 培养条件：

工作体积设为1 dm³。使用pH控制器自动添加12%氨水，维持pH值在7.0。温度维持在30℃。搅拌速度设为700 rpm。底物气体混合物的供给速率为2 dm3/min（相当于2vvm，即每分钟体积通风率）。

• 气体循环系统：

使用玻璃罐式发酵器（总体积2 dm³）作为反应器。气体室（总体积2 m³）充满氢气、氧气和二氧化碳。气体通过泵混合，然后通过无菌过滤器和循环泵送入发酵器。发酵器中未消耗的气体返回气体室，并通过气体回流线再次供应给发酵器。

• 安全措施：

安装压力传感器，当内部压力超过0.5 kg/cm²时，将气体排放到室外。所有电气设备均为防爆型。气体室和所有相关设备安装在室外，气体回收线用油绝缘处理。使用可燃气体探测器与气体供给线的关闭装置相连，以便在检测到系统泄漏时中断气体供应。

• 氧气供应：

通过防爆电磁阀和溶解氧（DO）控制器，间歇性地将纯氧直接供应到培养液中。DO控制器的初始设定值为1.8 ppm，随着发酵过程的进行，手动降低设定值，以确保返回线中的氧气浓度不超过爆炸下限。

• 监测与分析：

使用气相色谱法测定气体相的组成。使用膜型DO电极监测培养液中的溶解氧浓度。通过光谱光度计测定细胞浓度，并将其转换为干细胞重量。通过气相色谱法测定P(3HB)的浓度。

• KLa值测定：

使用亚硫酸盐氧化法在以下条件下测定KLa值：工作体积1 dm³，通气率2 vvm，搅拌速度700 rpm，温度30℃。

• 发酵结果：

初始气体混合物组成为H₂:O₂:CO₂ = 85.2:6.3:8.3。随着培养的进行，微生物指数增长，特定生长率约为0.25 h⁻¹。当细胞浓度增加到约10.1 g.dm⁻³后，溶解氧浓度降至约0 ppm，此时开始积累P(3HB)。在氧气限制条件下，经过40小时培养，细胞浓度增加到约91.3 g.dm⁻³，P(3HB)浓度为61.9 g.dm⁻³。

H.E.L的BioXplorer 生物反应器专为生物培养、生物合成设计：从培养条件控制（温度、搅拌、pH）、自动液体气体进料、代谢状态监测（细菌浓度、尾气分析）、实时在线数据记录分析等方面为客户提供完全的解决方案。

来源：Tanaka, K., Ishizaki,A., Kanamaru, T., & Kawano, T. (1995). Production of poly(D-3-hydroxybutyrate) from CO2, H2, and O2 by high cell density autotrophic cultivation of Alcaligenes eutrophus. Biotechnology and Bioengineering, 45(3),268-275. 

关于HEL：

H.E.L——Hazard Evaluation Laboratories 成立于1987年，总部设在伦敦，在中国、美国、德国、意大利、印度拥有分公司。全资的赫伊尔商贸（北京）有限公司于 2020年在北京设立。

H.E.L最初是一家过程工艺优化及反应危害评估的专业咨询机构，对研究机构和生产企业承接工艺过程研发项目；同时提供安全咨询，包括事故调查、HAZOP研究、安全设施的设计及制度管理等。目前，H.E.L是全球首屈一指的过程工艺及安全专业咨询机构，同时已经发展成为一家致力于为客户提供专业的过程工艺优化及反应危害评估设备的国际集团企业。

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