马匹中生长激素滥用：IGF-1质谱识别和定量程序的初步评价
针对赛马中生长激素（GH, 生长激素）滥用的怀疑，目前已将更多的精力放到GH检测方法上，由于其半周期小于15 min，这种激素的检测窗口非常短，因此需要识别其它可能的次级标记物进行研究。研究表明，对马或牛进行生长激素给药后，发现血浆中类胰岛素生长因子1（IGF-1）的浓度大大提高。IGF-1是由70个氨基酸组成的、质量数为7.5 kDa的蛋白质，用于细胞生长和繁殖，在人体和马匹中其结构是相似的。相对于本底浓度，对纯种马GH给药后，IGF-1浓度大大增加的重要性进行了研究。超过来自三个大洲的2000个赛马（包含不同性别、年龄），对IGF-1的浓度进行了检测，平均浓度为310 ng/ml。通过GH处理过的受体，IGF-1大大超过其本底浓度，平均超过4倍。这清楚表明，设定IGF-1的阈值是可能的，血浆中设定在700 ng/ml左右，超过这个值，就表明GH滥用。
对于IGF-1的研究，人体中IGF-1免疫放射分析（IRMA）方法（DSL-2800, Diagnostic Systems Laboratories, Webster，TX, USA）验证后也适用于马血浆的分析，表明这个可靠、耐用方法适合作为检测马血浆中IGF-1是否超过阈值的筛选方法。但是，马血浆中的其它受体也可能与人类IGF-1抗体显示某些交联反应，这时这种免疫诊断分析的特异性就很难进行评价，对于GH滥用的起诉，需要更特异、更准确的IGF-1定量方法，方法学上也要求证明被定量的物质就是IGF-1，也就是具有高度的特异性。质谱被证明特别适合于这类分析，也经常用于检举和起诉的目的。
本文研究了一个LC-ESI-MS方法，用于血浆中低浓度IGF-1的定量，为了确保被定量的物质是IGF-1，至少在部分上说明这个蛋白质的结构是必要的。选择的鉴定方法，包括蛋白质的酶解，酶解后的多肽大部分成为合适的小分子（10个氨基酸残基或更小）。串联质谱实验（MS/MS）得到更多碎片能够与酶解的肽结构关联起来。酶解肽的色谱分离的保留时间，结合分子量，必须与IGF-1标准品符合。另外，这些肽的MS/MS碎片质谱图也必须与期望的结构一致，必须与IGF-1标准品得到的结果一致。
与IGF-1相关的化合物，Arg3-IGF-1作为内标，它是市场上可以买到的高纯度研究级蛋白质。利用精氨酸残基（Arg3）取代存在马体中IGF-1的一个氨基酸残基（Glu3）。IGF-1的多细胞抗体与这个内标具有高的交联反应，意味着可实现有效的亲和色谱分离，由于IGF-1与Arg3-IGF-1的结构不同，这个极性差别使HPLC分离成为可能，为IGF-1的定量提供了基础。
实验部分 试剂 重组IGF-1（受体级）和重组Arg3-IGF-1（受体级）来自于GroPep（Adelaide, Australia）。内源蛋白酶Glu-C（V8 蛋白酶）和内源蛋白酶Asp-N均为测序级采购自Roche Diagnostics（Mannheim, Germany）。乙腈和甲醇来自Riedel-de Haen（Seelze, Germany）。二硫代苏糖醇和三氟乙酸来自Sigma（St. Louis, MO, USA），乙酸氨来自Merck（Darmstadt, Germany）。 IGF-1的内源蛋白酶Glu-C酶解 方法参考先前使用IGF-1酶解方法。将重组IGF-1（20 ug）溶解在500 ul乙酸氨缓冲溶液（50 mM, pH 6.7）中，以1: 1（酶/底物）比例将内源蛋白酶Glu-C加入，接下来在37℃培养40 h，然后加入三氟乙酸使其终浓度达到0.5%（终止酶解反应），后将样品保存在-8℃下。样品仅仅在需要定性分析前进行解冻。 IGF-1的内源蛋白酶Asp-N酶解 下面的酶解程序基于前面描述的方法。将重组IGF-1（20 ug）溶解在500 ul乙酸氨缓冲溶液中（50 mM, pH 8.0），以1: 200（酶/底物）的比例加入Asp-N，接下来在37℃下培养15 h，为了减少酶解肽中的二硫键合，添加二硫代苏糖醇使其浓度达到4 mM，30 min后加入三氟乙酸使其终浓度达到0.5%，后保存在-8℃条件下。样品仅仅在需要定性分析前进行解冻。 液相色谱 HP 1090系列II型HPLC（Palo Alto, CA, USA），每个研究使用不同的流动相组成，这在相关的部分进行了描述。流速为250 ul/min，在柱前利用Upchurch Scientific分流器（Oak Harbor, WA, USA）进行分流，使进入Jupiter C18 250 x 1 mm i.d., 5 um, 300 Å色谱柱（Phenomenex, Torrance, CA, USA）的流速为50 ul/min，色谱分离在40℃条件下进行。 质谱 HPLC流动相通过ESI接口引入到Finnigan LCQ离子阱质谱（Thermo, San Jose, CA, USA），LCQ质谱具有MSn分析能力，利用Xcalibur软件控制。全部分析过程的离子源电压为4.50 kV，毛细管温度为200℃。鞘气气流为60 units、辅助气流为1 unit。离子捕获时间手动设定为100 ms、使用3个扫描时间段。对于MS/MS分析，母离子隔离宽度为3 Th、碰撞能为35%。 IGF-1的定性分析方法 HPLC流动相：1%甲酸的水溶液（A）和1%甲酸的乙腈溶液（B）。梯度条件：3%B运行5 min后，在45 min内增加到60%，然后在5 min内增加到90%，后保持5 min。对于两个IGF-1酶解样品，分别进样5 ul进行分析。扫描范围 m/z 300- 1500进行全扫描分析，利用Pepcut功能（Xcalibur Bioworks, Thermo, San Jose, CA, USA）分析内源蛋白酶酶解多肽的电荷状态和质量数。选择每个酶解肽的丰度大的多电荷离子为母离子，进行碰撞研究进行MS/MS实验。利用Sequest软件（Thermo Xcalibur Bioworks）测定观察碎片和理论碎片的相关性。 IGF-1的定量分析方法 使用等度HPCL流动相：1%甲酸水/乙腈（73: 27, v/v）。IGF-1和Arg3-IGF-1的混合样溶解在流动相中为校正样，取2 ul注入HPLC，用于测试结果中ng量的指示。m/z 940- 1300的全扫描分析适用于IGF-1和Arg3-IGF-1，利用Thermo的Xcalibur Bioworks蛋白质软件，对多电荷蛋白质信号进行去卷积处理，得到质谱的中性分子量。 结果和讨论 IGF-1的定性分析方法 对于低含量的IGF-1的酶解，使用不同的水解酶并对结果进行了评价。对蛋白的消解来说，胰岛素是常使用的。然而结果表明：酶解率低、无法识别的非特异性酶裂解。这些也能在胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶酶解方法中发现。氰溴酸处理导致蛋白质复性的低产率，而嗜热菌蛋白酶酶解是不完全的。 低的酶解产率和非特异性酶解可能是由于IGF-1的三个二硫键在空间上限制了蛋白分解酶接近理论分裂位点。没经过后还原的衍生过程，可观察到二硫键的重组现象。在接下来的研究中，利用二硫代苏糖醇还原二硫键，自由巯基利用碘乙酸进行乙酰基化，或利用次乙亚胺进行乙氨基化，或利用乙烯基吡啶进行吡啶亚基化衍生。在典型低浓度IGF-1的血浆中，衍生是不完全的或者IGF-1衍生物的产率太低，以至于不能得到需要的灵敏度，样品也显示了很高的质谱分析背景。接下来研究集中在水解酶上，酶解未还原（二硫键未动）的IGF-1，得到具有高产率的几个酶解肽，然后未动的二硫键利用后水解进行还原。 研究采用IGF-1的内源蛋白酶Glu-C酶解，酶作用在谷氨酸残基的羧酸链进行断裂，利用内源蛋白酶Glu-C对非还原的IGF-1的酶解得到7个酶解物，这些可通过全扫描LC-MS观察到（表1）。除了预期得到的酶解产物，在IGF-1的Gly32、Asp12、Asp20和Asp53位羧基端的非特异、重复断裂也能被观察到。其中的两个三肽，对于IGF-1仅仅给了有限的结构信息，而另外两个肽通过二硫键互相连接，正象在天然IGF-1观察到的一样。利用二硫代苏糖醇处理后，含自由巯基（还原的）肽的产率非常低，这些物质的MS/MS实验仅能得到有限的碎裂信息。
IGF-1利用内源蛋白酶Glu-C酶解后，给出IGF-1的一些结构信息，但这些特征仍不能满足现在研究需要，因此需要利用内源蛋白酶Asp-N对IGF-1进行酶解，这个酶能引起天冬氨酸残基的氨链断裂，接下来通过二硫代苏糖醇处理将二硫键还原。LC-MS分析表明，酶解和还原过程产生了7个含自由巯基的肽段，针对IGF-1序列的每个肽段，组合在一起代表了它的全序列（表2）。利用这些数据可以组建IGF-1的酶解图（见图1）。可以看到在Glu58的氨基端具有非特异性断裂，而在其它的Glu残基上没有发现，可能是由于这个位置具有更易断裂的结构，因此得到了两个未预测到的肽段，肽段7是肽段6的一个Met59氧化形态。150 ng酶解的IGF-1得到的LC-MS全扫描谱图（m/z 300- 1100）显示了很强的峰（图2a）。
IGF-1碎片峰的识别通过m/z信号相对预期得到的酶解肽段（图2b）的重组色谱图进行了确认，观察到的多电荷离子列在表2中，图3a和图3b分别显示了肽段3和肽段7的谱图。虽然肽段1和肽段2在液相中没有实现基线分离（保留时间分别为50.22和50.47 min），但他们具有不同的质量数，因此在定量分析中不会影响结果。
就像前边利用MS/MS检测一样，接下来对还原的酶解物进行HPLC分析，对于每一个酶解肽段，双电荷离子（或者丰度更大的多电荷离子）被选择作为母离子，正象表2中列出的一样。MS/MS结果对于肽段的碎裂提供丰富的信息（表3）。既然肽段3（序列20-44, 通过MS/MS得到结构信息通常分子尺寸是太大的）分析揭示了氨基酸残基在肽的羰基端。通过Xcalibur Bioworks Sequest软件，观察到的肽酶解碎片与IGF-1的理论碎片实现了很好的符合。肽段5和肽段1的碎片谱图作为例子显示在图4a和图4b。
IGF-1的定量分析方法
选择Arg3-IGF-1作为内标用于IGF-1的定量，该化合物在结构和分子量上与马中的IGF-1是高度相近的，它具有70个氨基酸残基，一个氨基酸残基（Glu3）被精氨酸残基（Arg3）取代。使用这个蛋白质作为内标，是由于它在分子尺寸上与IGF-1相似，而且IGF-1的多细胞抗体同Arg3-IGF-1也有很高的交联反应，当使用亲和色谱作为马血浆样品中IGF-1浓度检测的分离条件，这点是非常重要的方面。设计的IGF-1定量分析LC-MS方法，包含分析该蛋白质和未经任何处理的内标物。当分析复杂样品时，全扫描检测方法的选择性使共提取物的信号排除。然而，由于Arg3-IGF-1（7675.8）和IGF-1（7648.8）非常相近的分子量，这些蛋白的多电荷形式更加接近，因此这两个蛋白的色谱分离非常重要。由于内标在Arg3链端具有一个自由氨基（而IGF-1没有），因此这两个蛋白具有不同的极性。这个特点可通过反相HPLC进行研究，实现了这两个相似化合物的基线分离，Arg3-IGF-1和IGF-1的保留时间分别为2.7 min和4.9 min。
这些蛋白质的质谱图显示了6和8质子化作用（6-8个正电荷），强峰是[M+7H]7+，观察到IGF-1的质核比是m/z 1093.4（理论值 m/z 1093.5），Arg3-IGF-1的质核比是m/z 1097.2（理论值 m/z 1097.5）。这些蛋白的质量数通过软件的去卷积选项进行了确认。为了定量，选择m/z 940- 1300的扫描范围，谱图包含了[M+6H]6+、[M+7H]7+和[M+8H]8+物质的信号，确认这些峰确实是IGF-1和内标的信号。m/z 1093.4 (±0.5)和1097.2 (±0.5)的信号分别被选择用于IGF-1和内标的定量。IGF-1在30- 500 ng（柱上浓度）浓度范围内，利用IGF-1/内标的比例、内标浓度为200 ng（柱上浓度），得到了很好的线性，相关系数（R2）为0.9974（n=6），见图5a和图5b。定量限（LOQ）在柱上浓度为30 ng时进行了测试，即使在这么低的浓度下，也可观察到IGF-1和内标物高度特征谱图（见图5c和图5d）。更低浓度的线性没有进行测试。应用这个方法用于马血浆中IGF-1的定量成为目前研究的基础。
结论
本文开发了用于IGF-1定量的物质确定识别、IGF-1的定量方法。这包括在低浓度未还原（二硫键完好）IGF-1的酶解方法选择，为了得到自由巯基的酶解肽段，接下来进行酶解后还原这些二硫键。IGF-1利用内源蛋白酶Asp-N酶解后，接下来利用这种方式还原，然后进行全扫描LC-MS分析，可得到高度特征的色谱和质谱指纹谱图。为了清晰起见，给出了柱上浓度为150 ng（IGF-1）的分析结果，但浓度为20 ng得到的数据也很容易被解析。由于非特异的酶解反应，观察到两个酶解肽段，一个肽段也在蛋氨酸氧化态形式额外观察到，酶解肽段和预测的肽段是不一致的。酶解肽段的ESI-LC-MS/MS分析，表明得到的碎片与理论碎片（通过质谱计算机软件产生）具有很好的一致性。正确酶解肽段的关联技术，结合这些肽段的期望碎片，样品和IGF-1能被看作高度特异的识别方法。
开发了一个ESI-MS全扫描方法用于低浓度IGF-1的定量，使用Arg3-IGF-1作内标，在柱上浓度为30 ng（LOQ）到500 ng之间，得到了很好的线性。全扫描代替选择离子监测用于IGF-1和内标的定量，这不仅通过色谱保留时间，也通过特征的电喷雾质谱多电荷离子形式，使这些物质识别成为可能。
这个初级研究描述的方法，正被应用于马血浆中IGF-1的浓度检测。IGF-1的滥用阈值设定在700 ng/ml左右，并得到几毫升马血浆样品，这个方法很适用于IGF-1的高灵敏度定性与定量分析。
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