尽管 5ppm 的高质量准确度被认为是确定元素组成的必要条件，但研究表明，仅依靠这一指标不足以确定未知化合物的分子式。即使质量准确度达到亚 ppm 级别，仍存在大量化学上可行的候选分子式需要筛选，尤其是当离子质荷比（m/z）大于 400Da 时。

幸运的是，除了单同位素峰的单点准确质量测量外，还有其他重要信息可用于分子式确定。对于特定离子，无论其同位素或同量异位素是否完全分离，完整的同位素丰度分布都包含了同位素分布精细结构的关键信息，而这种精细结构由元素组成决定。简单测量同位素峰（M、M+1 等）的相对强度，可作为筛选分子式列表的有效补充手段，尤其对于含溴（Br）、氯（Cl）或硫（S）的化合物，它们具有显著的同位素特征。其他方法包括简单的计算机建模，以及更复杂的、假设峰型符合高斯函数或其他函数的建模方法。然而，这些方法都只能对真实的同位素丰度分布进行粗略近似，因为实际测得的峰型要么未知，要么无法用于建模，导致建模误差可达数个百分点。这一误差水平远大于不同分子式之间通常存在的细微差异，从而在很大程度上限制了同位素丰度分布信息的实用性。在飞行时间质谱系统中，离子到达时间分布（峰形）具有典型的长尾特征，要实现足以区分不同分子式的峰形函数精准建模，难度更大（甚至可能无法实现）。

下文将以 DART-AccuTOF 系统的实际案例为基础，强调飞行时间质谱峰形校准在分子式确定中的重要性，并验证使用 MassWorks sCLIPS（自校准线形同位素丰度分布检索）技术无需内标或外标校准物即可确定分子式的可行性。

1. 结果与讨论

图 1（上图）为导入 MassWorks 软件的完整质谱图，图 1（下图）为目标未知离子（标称质量 319Da）对应的质谱区段。

图 1： DART-AccuTOF  系统的平均质谱图

（上图 —— 完整质谱图，下图 —— 未知离子（319Da）对应的质谱区段）

图 2 展示了 MassWorks sCLIPS 的常规数据处理流程。与适用于单四极杆等低分辨率系统的 CLIPS 技术相比，sCLIPS 的关键区别在于：利用未知离子自身的单同位素峰进行仅峰形校准，无需涉及质荷比（m/z）轴。该方法的原理基于以下三点：

• 未知离子的单同位素峰（校准峰）与其他同位素峰的质荷比（m/z）最为接近；

• 未知离子的单同位素峰（校准峰）与其他同位素峰的检测时间最为接近；

• sCLIPS 技术适用于高分辨率质谱系统（此类系统中，单同位素峰与 M+1 等其他同位素峰分离效果良好），其初始质荷比（m/z）测量准确度通常已足够高，无需额外进行质荷比校准。
  

图2：高分辨率质谱系统中用于分子式确定的 MassWorks sCLIPS 分析流程

完成校正后，MassWorks软件中的谱图准确度指标将用于评估所有候选分子式：这些候选分子式需满足两个条件，一是其单同位素精确质量落在根据实际单同位素峰测得的准确质量所设定的质量容差范围内，二是其元素组成符合给定的化学约束条件。谱图准确度最高的分子式，极有可能是目标未知离子的正确分子式。

图 3（上图）为单同位素峰经 sCLIPS 校准前后的峰型函数，图 3（下图）为完整同位素丰度分布经 sCLIPS 校准前后的峰峰函数。校准后的理想峰型明显补偿了飞行时间质谱峰型的长尾特征，且未出现明显的分辨率损失。需注意的是，在 318Da 处可能存在质谱干扰（很可能来自 M-H 离子），sCLIPS 分子式确定过程中也会考虑这一干扰因素。

图 3：目标离子的原始质谱图（黑色）与峰峰型校准后质谱图（红色）对比（上图 —— 单同位素峰，下图 —— 包含可能的 M-H 离子的完整同位素丰度分布）

表 1 列出了 sCLIPS 分子式确定的参数与结果。需注意的是，已将可能存在的 M-H 形式输入Mixture Search。相应地，谱图准确度的计算范围设定为相对于测得的准确质量（319.1043Da）±1.5 至 4.5Da，以覆盖可能包含干扰离子的完整同位素丰度分布。在设定的 ±10mDa 质量容差范围和表 1 所列其他化学约束条件下，共筛选出 70 种不同的候选分子式。其中，正确分子式C₁₇H₂₀N₂SCl的谱图准确度最高，达 97.27%。

表1：sCLIPS 分子式分析的参数与结果（仅展示 70 个候选分子式中的前 16 个）

MassWorks 软件中还可点击查看候选分子式列表中的每一个分子式，并交互式地对比校准后的质谱图与根据该分子式计算得出的理论质谱图的匹配情况。图 4 为排名第一的正确分子式（C₁₇H₂₀N₂SCl）对应的校准质谱图与理论质谱图的叠加对比。结果显示，包括 M-H 离子贡献在内的完整同位素丰度分布均实现了出色的谱图匹配。实际上，软件还显示 M 离子与 M-H 离子的相对丰度分别为 91% 和 9%。对比图 3 中原始质谱图与校准质谱图的差异可知，峰形校准在实现高谱图准确度和唯一分子式确定方面发挥了关键作用。更值得关注的是，这一过程无需使用外标或内标校准物。

图 5 为排名第二的分子式（C₁₅H₂₄O₃SCl，不含氮元素）对应的校准质谱图与理论质谱图的叠加对比，其谱图准确度为 96.52%。可以看出，在 320Da 峰处，拟合效果存在细微但明显的偏差，这再次凸显了采用已知峰型函数进行精确同位素丰度分布建模的重要性。有趣的是，若在表 1 的候选元素列表中排除氮（N）元素，该分子式将成为排名第一的候选分子式。这表明，交互式质谱图叠加功能也可作为判断分子式确定过程中应包含或排除哪些元素的有效工具。

图5：排名第二的分子式（C₁₅H₂₄O₃SCl，不含氮元素）对应的校准质谱图（红色）与理论质谱图（绿色）叠加对比（谱图准确度 = 96.52%）

类似地，图 6 展示了在较窄的相对质谱窗口（-0.5 至 4.5Da）内，未将 M-H 离子视为可能干扰离子时的 sCLIPS 谱图叠加结果。结果显示，谱图准确度再次下降（由表 1 或图 4 中包含 M-H 离子时的 97.27% 降至 96.36%）。从图形上也可观察到质谱拟合效果的下降：在 320Da 离子处，校准质谱图与理论质谱图存在明显的拟合偏差。

图 6：未考虑 M-H 离子时，排名第一的分子式（C₁₇H₂₀N₂SCl）对应的校准质谱图（红色）与理论质谱图（绿色）叠加对比（谱图准确度 = 96.36%）

2. 结论