谱图准确度（Spectral Accuracy）是用于衡量实验质谱与理论质谱同位素丰度模式相似度的指标，这种新指标已被证实会随质谱分辨率（RP）的变化而变化。在近期针对轨道阱（Orbitrap）数据的研究中，一些研究者观察到一个明显趋势：随着MS分辨率的提高，谱图准确度会随之下降。这可能是由于在较高分辨率下，谱图信号会产生相消干扰和 / 或相长干扰。

　　下文评估了在不同分辨率下，通过傅里叶变换离子回旋共振质谱仪采集的小分子数据的谱图准确度。结果表明，高分辨率可提供清晰的同位素信息，极大地助力未知化合物的鉴定。

　　谱图准确度辅助FT-ICR鉴定分子式

　　1. 数据采集

　　对包含丙咪嗪（Imipramine）、丁螺环酮（Buspirone）和利血平（Reserpine）在内的市售小分子混合物，采用 solariX 12 型傅里叶变换离子回旋共振质谱仪进行分析。数据采集时，设置不同的数据集采集大小（TD），范围从 512K 到 4M；对应的分辨率（在 m/z 400 处）为 66,000 至 530,000。

　　2. 数据分析

　　将所有通过傅里叶变换离子回旋共振质谱仪采集到的质谱数据使用 MassWorks 软件（CernoBioscience）中的sCLIPS功能进行分析，得到全部候选分子式的精细同位素丰度分布的高谱图准确度（SA）结果。

图1：sCLIPS的原理——sCLIPS 功能仅通过峰形校正，将实际峰形函数转化为已知的数学函数 —— 该过程以测得的单同位素峰本身作为校正标准。当这一功能应用于未知离子的整个同位素丰度分布时，未知离子的同位素丰度分布会被转化为具有相同已知峰形函数的校正后同位素丰度分布，随后该分布将用于计算任意给定候选分子式的理论质谱图，从而实现具有高谱图准确度（SA）的精确同位素模拟。

　　3. 结果与讨论

　　3.1 谱图准确度的整体表现

　　三种化合物（丙咪嗪、丁螺环酮、利血平）在不同分辨率下的整体谱图准确度表现较为稳定。其中，最低谱图准确度为 96.3%（m/z 609，@TD=4M 时），最高谱图准确度为 98.7%（m/z 386，分辨率为 64K 时）。除两个数据点外，所有测量结果的谱图准确度均高于 97.0%。

表1：m/z 386 离子的元素组成确定

　　3.2 谱图准确度与分辨率的关系

　　未观察到谱图准确度随分辨率提高而显著改善的明确规律，但当TD从 512K 增加到 4M 时，三种化合物的谱图准确度基本保持不变。不过，在相同TD时，m/z 281 和 m/z 386 的离子可达到 98.0% 以上的谱图准确度，而其他质荷比（m/z）离子的谱图准确度则约为 97.0% 或更低。

图2：谱图准确度与分辨率的关系

　　3.3 高谱图准确度对低质量离子的价值

　　在高TD（即高分辨率）条件下，低质量离子（如 m/z 281、m/z 386）的高谱图准确度对未知物鉴定具有极大价值，丁螺环酮（Buspirone）的案例研究（图 3）便证明了这一点。

图3：基于同位素精细结构的分子式确定——为仔细观察 A+1 和 A+2 峰的同位素精细结构，将该质量范围内峰的强度相对于最强峰进行归一化处理；黑色为理论计算质谱图；红色光为sCLIPS校正后的质谱图（分辨率 RP=4M）。

　　3.4 未知物分子式确定的通用策略

　　有效确定未知物元素组成的通用策略是，尽可能利用与未知物相关的化学知识，包括可能存在的元素种类、以及可能的质量偏差范围。

　　在代谢物鉴定和药物杂质测定等应用中，这类限制性参数很容易获取 —— 因为未知物或多或少与母体药物分子相关。因此，在这些应用中，通常仅依靠高质量准确度就足以确定唯一或接近唯一的分子式。

　　例如，在仅包含 C、H、N、O 四种元素，且质量偏差为 2.5 ppm 的条件下，对 m/z 386.2548 的离子进行搜索，仅得到两种可能的分子式（见表1中的第一个和第三个分子式）；但如果在相同质量偏差（2.5 ppm）下，分子式检索时额外加入 F 和 P 两种元素，则会得到 11 种可能的分子式。F 和 P 是单同位素峰中出了名的 “干扰元素”—— 在检索中加入这两种元素只会增加候选分子式的数量，而无法提供独特的同位素信息。

　　3.5 谱图准确度对未知物分子式鉴定的作用

　　幸运的是，这是一个能充分体现谱图准确度重要性的典型案例。如表 1 和图 3 所示，检索目标物丁螺环酮（Busprione）的理论计算质谱图与校正质谱图几乎完全匹配。它的谱图准确度（SA）达到了最高的 98.5%，在 11 种可能的分子式中排名第一。

　　丁螺环酮的高谱图准确度匹配不仅体现在单同位素峰上，更重要的是体现在 ¹⁵N、¹³C、¹³C¹⁵N、¹⁸O 和 ¹³C¹³C 的同位素峰上。这些独特的精细同位素结构构成了丁螺环酮的专属 “指纹”，为确定该分子的分子式提供了关键依据。相比之下，另外三种含单个氮原子的分子式（图 3）在 ¹⁵N 和 ¹³C¹⁵N 峰上均存在明显不匹配。同时，在 ¹³C、¹⁸O 和 ¹³C¹³C 峰上也能观察到不匹配现象。

　　借助谱图准确度，可大幅降低未知物鉴定对高质量准确度的要求。这一点可通过同一次检索中的两种分子式案例来证明：

　　分子式 C₂₁H₃₂O₂N₅（对应丁螺环酮，m/z 386.2556，表 1 中第 1 项）

　　分子式 C₁₂H₃₄O₂N₉FP（m/z 386.2557，表 1 中第 10 项）

　　这两种分子式的质荷比（m/z）仅相差 0.1 mDa，若仅依据质荷比数值，要区分它们极具挑战性。但二者的谱图准确度存在巨大差异（差值约 9%），这一差异可帮助我们有把握地排除 C₁₂H₃₂O₂N₉FP 作为该未知物候选分子式的可能性。

　　4. 结论

　　对于小分子化合物，在分辨率（RP）为 518K 至 4M 的条件下采集的 m/z 281 和 m/z 386 离子数据显示，其谱图准确度优异，均高于 98%。高谱图准确度与高分辨率相结合，充分利用了 A+1 和 A+2 峰的清晰同位素精细结构，从而实现了可靠的分子式确定。

　　利用谱图准确度确定分子式，可大幅降低未知物鉴定（unknown ID）对高质量准确度的要求。

　　关于MassWorks 软件

　　MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　关于绿绵科技

　　绿绵科技是Cerno Bioscience公司在中国区的总代理商，负责Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等产品市场推广、销售、售前/售后技术支持、应用支持。

　　若您想了解获取 MassWorks 产品的更多信息或应用，欢迎致电绿绵科技！