DNA 和 RNA 中胞嘧啶（Cytosine）和 5 -甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine）残基的脱氨基反应分别会生成尿嘧啶（Uracil）和胸腺嘧啶（Thymine），这是寡核苷酸类治疗药物的重要降解途径。遗憾的是，脱氨基产物难以通过色谱法与母体分子有效分离，因此脱氨基现象的检测和定量面临诸多困难。此外，脱氨基寡核苷酸与非脱氨基物质的质量仅相差 1 个质量单位，且后者的含量通常远高于前者，这一事实也给质谱法检测和定量带来了阻碍。对于较大的寡核苷酸，即使使用高分辨率质谱仪，也难以充分分辨重叠的同位素分布，尤其是电喷雾电离技术要求分析更高电荷态的离子，进一步增加了检测难度。

脱氨基的定性和定量分析

　　1. 脱氨基作用

　　·    在37°C和pH 7.4条件下，单链DNA中胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶残基的脱氨速率分别为2e-10s-1和1e-9s-1，或

　　·    在pH 7.4和37°C条件下培养一年后，含有四个5-甲基胞嘧啶残基的序列将包含约11%的分子具有一个脱氨基位点。

　　·    ssRNA、dsDNA及dsRNA的反应速率较慢。

　　·    在较高的pH值下，反应速率会显著加快。

　　·    对于DNA，可进行消化并测定尿嘧啶(U)含量，因DNA不含有尿嘧啶碱基

　　·    对于RNA而言，非脱氨序列中很可能已存在大部分U碱基，因此需要检测到少量U碱基向大量U碱基的转变

　　·    对于 DNA 而言，未发生脱氨基的序列中本就存在大量胸腺嘧啶（T）碱基，因此需通过酶解手段，在高丰度 T 碱基的背景下检测出微量的 T 碱基增量（源于脱氨基反应）.

　　2. 分析方法

　　即使使用最先进的质谱仪器，在寡核苷酸水平上检测脱氨基现象仍然具有挑战性。这是因为母体化合物与单脱氨基化合物之间仅相差 1 个质量单位（在电荷数 z=4 时，质量偏差为 0.25 原子质量单位），在典型的杂质谱分析实验中极难检测到。

　　尽管在 98-99% 未脱氨基主体成分存在的情况下，检测对应 1-2% 脱氨基杂质的谱图差异极具挑战性，但上述两种质谱图之间存在稳定且系统性的差异，该差异远超检测中的随机噪声。为识别此类水平的谱图差异，需开发一种涵盖质荷比（m/z）与质谱峰形的新型校准方法 —— 该方法可基于相关物质的已知元素组成进行精确同位素模拟，并能准确计算混合物中各物质的相对浓度。

　　3. MS的谱图准确度校正方法

　　MassWorks采用的MS峰型校正技术，将实际峰形函数转化为已知的数学函数 —— 该过程以测得的标准物质的同位素丰度分布轮廓峰本身作为校正标准。当这一功能应用于未知离子的整个同位素丰度分布时，未知离子的同位素丰度分布会被转化为具有相同已知峰形函数的校正后同位素丰度分布，随后该分布将用于计算任意给定候选分子式的理论质谱图，从而实现具有高谱图准确度（SA）的精确同位素模拟。

MassWorks质谱校正的原理与流程

　　当已知一种或多种元素组成标准时，通过已知的精确质量及关键的数学峰形函数，可对多电荷寡核苷酸的质谱进行校准，从而在后续混合物分析中实现脱氨基杂质的定量建模。

　　将测得的脱氨基组分浓度百分比与已知的加标脱氨基百分比进行作图分析，通过三组平行实验，从 20% 到 1% 的浓度范围内均获得了良好的线性回归曲线。尽管截距和斜率与理论值 0.0 和 1.0 存在显著差异，但在 1-5% 这一具有实际应用意义的脱氨基水平下，实现精准检测是完全可行的。

　　实验表明，使用单四极杆液相色谱/质谱联用仪（LC/MS）时，寡核苷酸与其脱氨产物之间存在可观测且一致的谱图差异，差异幅度至少达到5%。这表明脱氨分析完全可以在常规LC/MS仪器上实现。

　　4. 结论

　　微小的质谱差异对于区分和定量脱氨基产物与其对应的寡核苷酸等结构相似物质具有重要意义。

　　多电荷寡核苷酸MS谱图的测量结果可通过已知的数学峰形函数进行校准，更重要的是，这一校准能够为下一步混合物分析中的脱氨基杂质定量提供精确的模型支持。

　　关于MassWorks 软件

　　MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　关于绿绵科技

　　绿绵科技是Cerno Bioscience公司在中国区的总代理商，负责Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等产品市场推广、销售、售前/售后技术支持、应用支持。

　　若您想了解获取 MassWorks 产品的更多信息或应用，欢迎致电绿绵科技！