作者：Zhenzhen Wang、A. Daniel Jones，密歇根州立大学，密歇根州

　　同位素标记与液相色谱 -质谱（LC-MS）定量分析相结合，为揭示植物及其他生物中特化代谢物（天然产物）的生物合成动态提供了一种极具前景的方法。代谢物中的同位素模式和比例蕴含着追溯特定化合物生物合成历程的宝贵信息，该技术有望将代谢流分析拓展至各类生物体内复杂的特化代谢物研究中。然而，高标记代谢物的同位素模式可能呈现出极高的复杂性，因此在分析生物基质中大量代谢物的标记情况时，亟需精准且高通量的数据处理方法。本研究将展示一种基于质谱解卷积的新方法，如何实现对 13C 标记天然产物复杂同位素模式的同时定量分析。

图1：植物特化代谢物全局同位素标记与谱图分析流程图

 ¹³C 标记植物代谢物复杂同位素峰形研究

　　1. 方法

　　植物¹³C标记与 LC-MS 分析

　　将番茄（M82 品种）种植在密封生长室中，通过 ¹³CO₂进行特化代谢物标记。采用超高效液相色谱（UHPLC）结合 Waters G2-S 四极杆飞行时间质谱（QTof），以连续模式进行多重非选择性碰撞诱导解离（CID），获取分子离子和碎片离子中 ¹³C 的掺入情况数据。使用Cerno Bioscience公司的商用软件 MassWorks软件处理（包括共洗脱代谢物的质谱数据）。

图 2. 未标记酰基蔗糖 S4:17（C₃₀H₄₉O₁₇）及多种标记型 S4:17 的电喷雾电离（ESI）负离子模式质谱图。在不同标记天数的小叶提取物样品中检测到 1-5 种不同的标记形式。粗提物通过超高效液相色谱  -飞行时间质谱（UHPLC-TOF MS）进行分析。未标记分子来自在环境大气条件（主要为 ¹²CO₂）下生长的对照植物

　　富集度计算的数据处理

　　将原始质谱数据从 MassLynx 软件导出至 MassWorks 软件，随后利用未标记化合物的单同位素离子进行全面的质谱校准，包括质量误差校正和质谱峰形校正。校准完成后，使用 MassWorks 软件对 ¹³C 富集的同位素体进行定量分析。

　　2. 结果与讨论

　　通过 LC-MS 分析，根据精确质量、特征碎片质量和色谱保留时间，鉴定出 20 多种酰基糖、芦丁和番茄碱。由于这些特化代谢物具有多样性，若使用 Quanlynx 软件（Waters 公司）通过积分峰面积对所有 ¹³C 标记的同位素体进行定量分析，需要耗费大量人工输入。例如，含量最丰富的酰基糖 S4:17 分子中含有 29 个碳原子（结构见图 1），高标记状态下，其质谱图中可检测到多达 29 种同位素体。图 2 展示了标记型 S4:17 质谱图的复杂性。当对分子离子进行碎裂以获取代谢物亚结构中的标记信息时，对所有关键碎片的研究将进一步增加数据处理的复杂性。此外，若不进行质谱解卷积，直接对复杂混合物中的所有分子和碎片同位素体进行定量，会增加定量误差的可能性。

图 3. 重叠质谱信号精准定量的挑战。上方谱图为未标记酰基蔗糖 S4:17，下方三张为掺入不同数量 13C 的 S4:17 标记形式的解卷积谱图

　　如图 3 中含三种不同 ¹³C 标记代谢物组成的模拟混合物示例所示（三种代谢物分别为 C₉¹³C₂₁H₄₉O₁₇、C₈¹³C₂₂H₄₉O₁₇和 C₇¹³C₂₃H₄₉O₁₇），质荷比（m/z）704 的总信号（图 3 中未显示）主要来自这三种代谢物，即 C₉¹³C₂₁H₄₉O₁₇的 A+2 峰、C₈¹³C₂₂H₄₉O₁₇的 A+1 峰以及 C₇¹³C₂₃H₄₉O₁₇的单同位素峰（M 峰）。假设三种代谢物丰度相近，仅基于 C₇¹³C₂₃H₄₉O₁₇的单同位素峰进行定量时，将分别遗漏来自 C₈¹³C₂₂H₄₉O₁₇的 A+1 峰和 C₉¹³C₂₁H₄₉O₁₇的 A+2 峰的约 10% 和 4% 的信号贡献（均为相同标称质量下的贡献）。

图 4. LC-MS 谱图分析中标记酰基糖 S4:17 的校准后质谱图（红色曲线）与原始数据质谱图（黑色曲线）。该谱图显示 S4:17 分子的弱标记型与高标记型组成复杂混合物体系。为适配第二步的解卷积分析，通过校准对峰形进行修正优化；m/z 701 处的同位素体峰放大图展示了校准前后的峰形细节差异。

　　本研究中，我们采用了一种新方法对混合物中的所有同位素体进行同时定量。该方法假设所观测到的复杂谱图是每种可能的 ¹³C 标记化合物的线性组合，且可通过谱图解卷积技术进行数学分离。定量分析的核心流程是将计算得到的混合物谱图与实测复杂谱图进行比对。为实现精准定量，峰形校准至关重要：例如，若计算谱图为高斯峰形，而实测谱图峰形无明确规律，这种峰形差异将导致同位素体定量结果产生约 5-10% 的误差。如图 4 所示，峰形畸变的原始谱图（黑色曲线）经校准后，获得了对称且峰形明确的谱图（红色曲线），该校准后谱图也将用于生成计算谱图。

图 5. MassWorks CLIPS参数设定：对于已知化合物，可将其元素组成限定为精确分子式；针对该化合物的可能标记组成，定义标记元素（此处为 ¹³C 取代 ¹²C）的数量范围（本研究中，最少 1 个碳原子、最多 29 个碳原子可被 ¹³C 标记）。图 4 所示谱图的检索结果详见图 6。

　　本研究实现了酰基糖同位素体的精准丰度定量，计算得出的各标记模式摩尔百分比（mol%）与手动积分峰面积结果具有良好一致性。例如，图 6 所示的校准后谱图通过图 5 设定的参数进行 CLIPS 检索，结果从标记混合物中识别出 30 种不同形式的 S4:17 代谢物及其相对含量（见图 6 附表）。其中未标记型 C₃₀H₄₉O₁₇在混合物中占比仅 1.1%，而高标记型分子（如 30 个碳原子中 23 个被 ¹³C 取代的 C₇H₄₉O₁₇[¹³C]₂₃）占比超过 11%。

图6. S4:17 的 CLIPS 检索结果（混合物组成及丰度百分比）。表格中列出了混合物中 S4:17 各标记型的相对丰度。

　　应用该方法对不同叶片发育阶段的 S4:17 丰度进行定量分析，结果支持我们早期的研究发现：标记开始后的前两天内，约 40% 的 S4:17 分子为新合成产物，剩余 60% 为未标记组分。大多数标记型 S4:17 含有 16-24 个 ¹³C 标记碳原子。此类组成信息将助力验证我们的假设 —— 酰基糖的生物合成过程为：在发育早期首先连接酰基，随后经过部分水解与重新酰基化反应完成合成。

　　3. 结论

　　通过 MassWorks 软件的质谱解卷积技术，实现了对含有多达 30 个重同位素的植物代谢物中 ¹³C 标记的自动化同时定量。

　　探索代谢动态有望增进我们对生物合成和分解代谢在代谢物流中的作用的理解。

　　关于MassWorks 软件

　　MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　关于绿绵科技

　　绿绵科技是Cerno Bioscience公司在中国区的总代理商，负责Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等产品市场推广、销售、售前/售后技术支持、应用支持。

　　若您想了解获取 MassWorks 产品的更多信息或应用，欢迎致电绿绵科技！