化合物分子离子或其加合离子的精确质量数常被用作佐证其分子式元素组成的依据。但实际情况是，即便将质量容差控制在亚百万分之一级别，仍会存在大量可能的候选化学式组成，且候选清单的数量会随质量数的增大呈指数级增长。对于合成化合物，研究人员会依据已有的化学知识设定限定条件，以此缩小筛选范围。Br与Cl元素具有独特的特征同位素丰度，二者会形成辨识度极高的同位素图谱，可据此验证化合物中的卤素含量，因此常被用作定性鉴别依据。不过，绝大多数数据处理软件仅支持人工目视比对同位素图谱。而MassWorks软件可对化学电离（CI）后，由单位分辨率四极杆质谱仪采集到的实测同位素图谱与理论同位素图谱进行一致性匹配分析。

GC/MS上分子式同位素分布对化合物的鉴定评价

　　从 154 份样品中，筛选出12 组标称质量相同的化合物对，其标称质量范围为363～498 Da。选取其中3 组化合物对作为示例，详细阐释化学电离（CI）模式下的质谱解析流程，以及精确质量分析后的同位素图谱评估方法。

　　实验用质谱为赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific）的 DSQ 型四极杆质谱仪，样品通过DIP 进样，先在 60 ℃ 保持 1 分钟，随后以 30 ℃/min 的速率升温至 340 ℃。所有样品均采用甲烷作为反应气开展化学电离（CI）。

　　四极杆质谱仪上精确质量数的测定分为两步：首先采用全氟三丁胺（PFTBA） 进行内标校准，随后借助Cerno Bioscienc 的 MassWorks™ 软件开展CLIPS分析。后者还能针对任一给定精确质量数的候选元素组成，生成对应的理论同位素图谱。

　　在四极杆质谱仪上，分子离子及其加合物的质量误差被控制在 15 ppm 以内。每一组元素组成定性结果均通过其同位素图谱完成验证。

表1：PFTBA碎片离的元素组成及其精确质量数

　　在以轮廓图（profile）模式采集样品质谱图的同时，将全氟三丁胺（PFTBA） 作为内标物引入离子源。借助 MassWorks™ 软件，选取表 1 中至少三种离子进行校准，得到了校准品的最优峰形（见图 1）。随后将所得的数学函数应用于样品质谱图，计算出经校准后质谱图的质心值。这些质心值被作为精确质量数，通过 CLIPS 功能模块筛选出可能的元素组成。最终的检索结果还会针对每一种候选元素组成，给出校准后同位素图谱与理论同位素图谱的对比数据。

图1：PFTBA碎片离子m/z 69的实测轮廓图、理论图谱、理论质心

　　1. 比较同重化合物

　　将同重化合物分为含氯型与不含氯型两类。两类化合物的质谱图如下所示：图 2 中的每一种含氯化合物，均能在图 3 中找到对应的非含氯同系物。左侧组别化合物的结构中均含有邻氯苄基官能团，并带有酰基（R₁） 和环烯基四氢吡啶（R₂） 取代基；与之相对，右侧组别化合物均为喹啉基甲醇醚衍生物。

图2：上述化学电离（CI）质谱图显示，[M-H]⁻ 离子与 [M+H]⁺ 离子的信号出现重叠，致使谱图呈现出含两个溴原子的假象。而 [M+C₂H₅]⁺ 与 [M+C₃H₅]⁺ 两种离子的同位素图谱（见内嵌放大图），则证实了化合物中存在一个氯原子。

图3：上述化学电离（CI）质谱图中出现了 M⁺ 离子与 [M+H]⁺ 离子，二者极易被分别误判为 [M-H]⁺ 离子与 M⁺ 离子的组合形式。相较于质荷比m/z 377 的离子峰，偏移量分别为 28 Da 和 40 Da 的 [M+C₂H₅]⁺ 与 [M+C₃H₅]⁺ 加合离子（见内嵌放大图），可证实体系中确实存在 [M+H]⁺ 离子。

　　化学电离（CI）质谱图显示，这些同重化合物对可通过各自独特的离子图谱实现快速区分。少量碎片离子可为化合物结构提供佐证；而标称质量的测定，则依托于中高强度的质子化分子离子峰，以及另外两种甲烷气体加合离子峰完成。

　　2. 精确质量

　　表 2 中列出了经MassWorks软件的CLIPS 方法得到的理论质量数与实测质量数，同时附上了相应的百万分比质量误差（ppm 值）。这些同重化合物可通过各自的精确质量数实现快速鉴别。为了能在同一次检索中得到某一同重化合物对的全部元素组成结果，CLIPS 检索的质量容差不得不放宽至 0.5 Da。

表2：同重化合物的精确质量测定值和理论值

　　3. 同位素分析

　　在无干扰的情况下，对化学电离（CI）质谱图中的同位素图谱进行分析验证是一项简便的操作，分析准确率可达 95% 以上。然而，正如图 2 与图 3 所示，当 [M-H]⁺、M⁺ 及 / 或 [M+H]⁺ 离子的图谱发生重叠时，分析准确率会显著下降。人工计算这些干扰离子图谱的相对强度比，是一项极为繁琐且耗时的工作。

图4：上面的橙色和黄色离子轮廓来自C20H24NO2SCl（图2）和C25H19N30O（图3）的校准质谱图。图 2 左上角的橙色图谱被判定为[M-H]+ 与 [M+H]+离子的叠加信号，基于其与下方绿色图谱95.1%相似度，可证实该橙色图谱与M+离子图谱存在重叠。同时，右角的黄色轮廓与M+和[M+H]+离子的淡紫色轮廓完全匹配。同理，底部的[M+C2H5]+同位素谱图也与蓝色图谱高度吻合。

　　借助MassWorks的CLIPS 方法实现校准质谱图与理论质谱图的自动化比对，能够通过生成混合离子的离子图谱，解决离子信号重叠带来的复杂问题。如图 4所示，当将干扰离子的潜在元素分子式也纳入 CLIPS 的参数设置范围后，模拟结果的相似度百分比均达到了95% 以上。

　　当样品中存在具有多种同位素丰度的元素、且观测到更为复杂的同位素图谱时（例如有机金属化合物的情况，相关数据未展示），该软件同样具有极高的实用价值。

　　4. 结论

　　在单位分辨率质谱仪上以轮廓模式采集数据，并借助 MassWorks 软件完成数据处理，可针对全氟三丁胺（PFTBA）等质量校准品生成“最优峰形”函数 。

　　该“最优峰形” 函数可用于质谱内标校准，进而通过 CLIPS 功能模块实现精确质量数与元素组成的测定。

　　CLIPS 功能模块还能将纯离子及重叠离子的同位素图谱，与理论图谱进行自动化比对。

　　在报告含氯等具有复杂同位素图谱特征的化合物的精确质量数时，必须提供已知相似度百分比的理论质谱图，以此佐证元素组成的定性结论。

　　关于MassWorks 软件

　　MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　关于绿绵科技

　　绿绵科技是Cerno Bioscience公司在中国区的总代理商，负责Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等产品市场推广、销售、售前/售后技术支持、应用支持。

　　若您想了解获取 MassWorks 产品的更多信息或应用，欢迎致电绿绵科技！