文章来源：ASMS 2026，TP 493

　　作者：Christoph W. Turck ¹、Wenyun Lu ²、Joshua D. Rabinowitz²、Yongdong Wang ³

　　（1 德国慕尼黑 Silantes公司；2 美国新泽西州普林斯顿市 普林斯顿大学 刘易斯・西格勒整合基因组学研究所；3 美国内华达州拉斯维加斯市 Cerno Bioscience公司）

　　1. 引言

　　目前，尚无法实现组织与生物体液中大量代谢物的并行定量检测。传统方法需要为每种目标代谢物单独制备稳定同位素标记标准品，并将其加入待测样本中完成定量。本研究旨在建立一种稳定性更强、成本更低的生物分子定量方法，实现人体组织与生物体液中海量代谢物的并行定量，服务于制药、临床医学及相关科研领域。

　　参照蛋白质组学已报道的研究思路，本研究建立了一种全新方法，可对人和小鼠组织、血浆中的含氮代谢物进行全域定量。该方法结合活体啮齿动物体内稳定同位素代谢标记技术、基于定量质谱的代谢组学数据采集技术以及生物信息学分析技术开展研究。

　　2. 研究方法

　　样本制备、液相色谱  -质谱（LC/MS）数据采集及后期软件分析

　　实验选用 ¹⁵N 标记率约 93% 的 C57BL/6 小鼠与未标记 C57BL/6 小鼠的肝脏组织作为实验材料，采用甲醇：乙腈：水 = 40:40:20混合溶液（添加 0.5% 甲酸）提取代谢物。完成蛋白沉淀处理后，利用赛默飞 Exploris 480 轨道阱质谱仪联用范奎什超高效液相色谱仪对代谢物提取液进行 LC/MS 检测。同一份样本分两次进样，分别采用电喷雾正离子模式（ESI+）与电喷雾负离子模式（ESI-）分析，质谱分辨率分别设置为 24 万与 48 万。

　　借助 MassWorks 软件中的自校正线型同位素轮廓检索（sCLIPS）功能，对代谢物及其各类 ¹⁵N 标记异构体开展谱图准确度（SA）校准，同时输出谱图准确度数值与各组分相对摩尔浓度。由于样本 ¹⁵N 标记不完全，含氮代谢物会形成复杂且相互重叠的同位素异构体图谱，本研究采用多元回归分析法完成图谱解析与定量计算。

　　为验证新方法的可行性，研究从数百乃至数千种潜在代谢物中，挑选多种丰度较高、含氮原子数量各不相同的代谢物，分别在电喷雾正、负离子模式下开展分析。

　　3. 结果与讨论

　　已有多篇文献探究了影响轨道阱 LC/MS 系统质谱准确度的关键因素。本研究首先检测未标记代谢物，以此确定实验体系可达到的质谱准确度水平，相关数据见下表。

　　谷氨酰胺与谷氨酸的单同位素质量数相差约 1 道尔顿，二者会发生共流出且质谱区间相互重叠，这一现象与标记不完全时未标记离子和标记离子混合体系的特征高度相似。对于含有m个氮原子的代谢物，样本中会同时存在掺入 0 至m个 ¹⁵N 原子的各类同位素异构体。而 sCLIPS 技术可结合离子序列，通过谱图准确度混合分析法识别并解析上述多种离子组分。

图1：谷氨酰胺与谷氨酸的共流出峰（上）及混合质谱图（下）

　　自校正线型同位素轮廓检索（sCLIPS）混合分析法，可在同一质谱窗口中对多种共流出的标记 / 未标记代谢物进行同步分析。对于未标记的谷氨酰胺与谷氨酸（见图3-左），检测结果显示标记型代谢物的浓度基本为零。而在标记样本中（见图3-右），将不同同位素标记态与未标记态的代谢物结果加和后，谷氨酰胺与谷氨酸的总比值和未标记样本检测结果高度吻合，证实了本研究所用方法的可靠性。

图2：谷氨酰胺与谷氨酸混合物分析的sCLIPS参数设置

图3：谷氨酰胺与谷氨酸未标记和标记的含量结果

　　三磷酸腺苷（ATP）分子含有 5 个氮原子，因此实验选用了更宽的质谱检测区间。借助 sCLIPS 功能，可覆盖 0~5 个 ¹⁵N 原子掺入的所有情况，最多可区分 6 种不同离子形态的混合组分。对未标记样本进行检测时，所有标记型离子的摩尔浓度计算结果均趋近于零，再次验证了该方法的有效性。在标记样本中，ATP 各形态占比为：未标记态 2.3%、4 个 ¹⁵N 标记态 11.9%、全 5 个 ¹⁵N 标记态 85.3%，表明同位素掺入效果良好。

图4：三磷酸腺苷¹⁵N 标记混合物分析的sCLIPS参数设置

图5：三磷酸腺苷¹⁵N 标记分析结果

　　烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）分子含氮原子数量更多，其检测需要进一步拓宽质谱区间，以区分最多 8 种潜在离子组分，该样本的验证结果同样理想。同时该物质的 ¹⁵N 同位素掺入水平较高：全位点 ¹⁵N 标记占比 56.9%、6 个位点 ¹⁵N 标记占比 37.4%、5 个位点 ¹⁵N 标记占比 5.4%。同位素掺入比例及分布特征，不仅可用于反馈标记流程状态、开展质量控制，还能提升复杂代谢组样本中各类代谢物定量结果的精准度。

图6：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸¹⁵N 标记混合物分析的sCLIPS参数设置

图7：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸¹⁵N 标记与未标记的分析结果

　　4. 结论

　　初步验证了这套代谢组全域同位素标记与定量分析方法的可行性。后续仍需开展更多研究，优化混合标记体系的谱图准确度：例如测试低于 24 万、48 万的质谱分辨率，也可尝试在三重四极杆质谱仪上应用该方法。

　　为进一步验证方法可靠性，还需分析单氮原子的标记 / 未标记化合物混合样本。该技术最终落地应用，还需配套全自动化软件工具，实现代谢物筛查与定量一体化分析。

　　参考文献：

　　1. Mohammed, Y. et al, Mol. Cell Proteomics, 2025, 24(6), 100974

　　2. Wang, Y et al, Anal. Chem., 2010, 82, 7055-7062(17)

　　3. Kuehl, D. et al, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2021；e9103

　　4. Erve, J. et al, J AM Soc Mass Spectrom., 2009, 20, 2058-2069

　　5. Strife, R. et al, J Mass Spectrom., 2018, 53, 921–926

　　6. Graichen, A. et al, ASMS 2025 Poster ThP 474

　　关于MassWorks 软件

　　MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　关于绿绵科技

　　绿绵科技是Cerno Bioscience公司在中国区的总代理商，负责Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等产品市场推广、销售、售前/售后技术支持、应用支持。

　　若您想了解获取 MassWorks 产品的更多信息或应用，欢迎致电绿绵科技！

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