本应用文档全面介绍采用尺寸排阻色谱（SEC）/ 凝胶渗透色谱（GPC）开展分离与分子量测定的全流程关键操作步骤，重点阐述样品前处理、校准曲线绘制及数据解析核心要点。为直观演示整套操作流程，本实验采用搭载示差折光检测器（RID）的KNAUER AZURA® GPC/SEC系统，分别在水相体系中以普鲁兰多糖、四氢呋喃（THF）有机相体系中以聚苯乙烯（PS）为标样，在多款尺寸排阻色谱柱上完成校准曲线建立。实验采用多种糖类与聚苯乙烯标准品对两套校准曲线进行验证，验证结果优异，证实两套校准方案均具备可靠性能与广泛适用性。此外，本文梳理GPC/SEC分析中常见难题，并提供可落地的实操解决办法。

　　1. 引言

　　凝胶渗透色谱（GPC）、尺寸排阻色谱（SEC），较少使用的名称为凝胶过滤色谱（GFC），三者指代同一液相色谱分析技术，用于测定高分子材料关键理化参数，适用对象包含合成聚合物、生物高分子、多糖、蛋白质等。借助常规液相色谱设备，单次进样即可同步测定聚合物、蛋白质的分子量分布及部分结构特征，为研究材料功能特性与使用性能提供核心数据支撑。

　　三种命名对应的分离机理完全一致（见图 1），分离依据为分子流体力学体积，而非分子量；不同研究领域科研人员使用不同术语指代该技术。

　　·    凝胶渗透色谱（GPC）：多用于合成高分子、塑料领域化学研究者，该类材料大多仅可溶于有机溶剂，因此 GPC 常对应有机相分离体系。

　　·    尺寸排阻色谱（SEC）、凝胶过滤色谱（GFC）：多用于生物领域科研人员，用于蛋白质、寡核苷酸等生物分子纯化与分离，该类实验通常采用水相流动相，因此水相分析普遍称作 SEC 或 GFC。

　　高效液相色谱（HPLC）依靠分析物与固定相之间的化学相互作用实现分离，与之不同，凝胶渗透色谱不存在吸附、离子交换、分配等相互作用机制。

　　如图 1 色谱图所示，不同尺寸聚合物的洗脱曲线能够直观体现分子在色谱柱内的行为差异：小分子、低聚合度高分子可渗入固定相孔道内部，保留时间更长；反之，大分子难以进入孔道，随流动相快速流出，保留时间更短，详见图 1 右侧色谱图。

图1：GPC/ SEC分离原理

　　 校准曲线绘制是GPC/SEC的核心环节，直接决定分子量测定结果的准确度与可靠性。该步骤需使用已知分子量标准品绘制标准校准曲线，作为样品数据解析的参照基准（见图 2）。所选校准标准品应与待测样品材质尽可能相近，以保障检测结果最优。GPC/SEC校准曲线说明蓝色色谱峰代表该校准区间内分子量最小的分析物，红色色谱峰代表分子量最大的分析物。

图2：GPC/ SEC校准曲线示意图，蓝色峰对应校准范围内分子量最小物质，红色峰对应分子量最大物质

　　校准与样品检测过程中，溶剂、温度等实验条件必须完全统一，微小条件偏差都会造成样品表征结果出现显著误差。综上，该分离技术依靠分子尺寸/流体力学体积实现组分分离，但仪器输出结果为相对分子量，数值由校准曲线换算得出。

　　2. 样品制备

　　开展GPC/SEC分析时，溶剂选型直接决定样品溶解能力与分子稳定性。溶解过程严禁搅拌，涡旋振荡、离心等操作同样不推荐使用，上述操作会改变样品分子量分布与分子构象，造成检测结果失真、分析数据质量下降。样品浓度适用区间为 0.1–10 mg/ml；需注意高浓度样品会增大溶液黏度，干扰色谱峰形与保留时间，进而影响分子量分布与分子量数值测定。因此建议逐步降低样品浓度，直至色谱峰位置、峰形不再发生变化。若样品信号信噪比不足，可提升进样体积，而非提高样品浓度。

　　总体而言，样品需现配现测，尽快上机检测以获得最优数据；但部分样品完全溶解需要数天时间，因此样品溶解环节需保持足够耐心。

　　·    水相普鲁兰多糖校准标样配制

　　采用分子量覆盖 180–1450000 道尔顿的普鲁兰多糖标准品套装，标准品溶于纯水后静置 1 小时，确保完全溶解。

　　·    有机相聚苯乙烯（PS）校准标样配制

　　第一套聚苯乙烯标样分子量区间 266–66000 道尔顿，溶于四氢呋喃（THF）后静置 1 小时溶解；

　　为拓宽聚苯乙烯校准分子量范围，额外配套一套标样套装，套装内含 A、B 两组可拆卸刮片式标样，分子量覆盖 580–6545000 道尔顿；刮片置于装有四氢呋喃的样品瓶中，静置 1 小时完成溶解。

　　葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖配制方案：溶于纯水，室温无搅拌静置过夜，配制浓度 2 毫克 / 毫升，随后使用 0.45 微米尼龙滤膜过滤。

　　分子量 11600 道尔顿、336000 道尔顿的聚苯乙烯标准品配制方案：溶于四氢呋喃，配制浓度同样为 2 毫克 / 毫升，室温无搅拌静置过夜，采用 0.45 微米尼龙滤膜过滤。

　　3. 实验结果

　　·    色谱柱性能测试

　　凝胶渗透 / 尺寸排阻色谱上机检测前，需依据对应国标规范完成色谱柱性能测试：水相洗脱体系遵循 DIN EN ISO 13885-3 标准，四氢呋喃有机相洗脱体系遵循 DIN EN ISO 13885-1 标准。两份标准文件均规定，为保证检测结果重现性，色谱柱柱效（理论塔板数）必须达到最低限值。在规定实验条件下检测指定测试物质，通过下述公式对色谱峰进行评估：

　　标准要求：水相体系色谱柱每米理论塔板数最低 10000，四氢呋喃有机相体系色谱柱每米理论塔板数最低 20000。

　　本实验全部色谱柱均采购自 AppliChrom® 品牌，规格统一为 300mm×8mm。

　　水相检测方案采用两根色谱柱串联组合：两根色谱柱亲水高分子基材相同，但孔径规格不同；

　　四氢呋喃有机相检测方案采用单根宽孔径分布技术（BPT）色谱柱，固定相材质为苯乙烯  -二乙烯苯。各单柱、串联柱组合的柱效测试结果见表 1，所有色谱柱均满足标准验收指标。

表1：色谱柱性能测试结果

　　串联色谱柱是GPC/SEC常用手段，用于提升分离分辨率或拓宽分子量分离区间，色谱柱搭配方案选择至关重要：

　　·    相同孔径色谱柱串联：提升分离分辨率；

　　·    不同孔径色谱柱串联：拓宽整体分子量分离范围。

　　两种串联方案对比汇总见表 2。本实验选用两根基材一致、孔径分别为 150 埃与 350 埃的色谱柱，按孔径由小到大顺序串联，整体分离区间拓宽至 100–1000000 道尔顿（详见表 1）。

表2：单孔径色谱柱串联方案判定标准

　　采用不同孔径色谱柱串联前，必须保证各色谱柱的分子量分离区间存在重叠，避免出现检测空白区间。反例：SuperOH-P-100 色谱柱（分离区间 100–2500 道尔顿）搭配 SuperOH-P-400 色谱柱（分离区间 10000–5000000 道尔顿），两套色谱柱无法覆盖 2500–10000 道尔顿区间，搭配方案无效。

　　同时，孔径重叠区间分辨率会出现明显下降：不同色谱柱保留机理存在差异，区间重叠处分子保留行为不一致，色谱峰展宽，最终分子量计算结果出现偏差。由此可见，串联色谱柱选型至关重要。

　　关于色谱柱串联顺序：串联先后顺序不会改变样品保留时间、分子量分布计算结果，仅需保证整套实验全程串联顺序统一即可，可按孔径由小到大或由大到小串联。

　　·    校准曲线建立

　　本实验建立两套相对校准曲线：第一套为水相普鲁兰多糖校准曲线，第二套为四氢呋喃有机相聚苯乙烯校准曲线。

　　图 3 为水相体系 11 点普鲁兰多糖校准曲线，分子量覆盖 180–739000 道尔顿；分子量 1450000 道尔顿的标样（深蓝色瓶盖）超出该串联色谱柱的分离区间（表 1），因此未纳入校准拟合。11 组校准数据采用 5 次多项式拟合，所有标样偏差均低于 7%（表 3），相关系数无限接近 1（图 3），证明拟合效果优异，校准曲线检测准确度高。

图3：双柱 ABOA SuperOH-P-150 + ABOA SuperOH-P-350 水相体系 11 点普鲁兰多糖校准曲线。深蓝色瓶盖标样：1450000 Da、216000 Da、21900 Da、991 Da；浅蓝色瓶盖标样：739000 Da、107000 Da、9800 Da、504 Da；黄色瓶盖标样：348000 Da、49400 Da、6400 Da、180 Da；拟合函数：5 次多项式；相关系数 R²=0.999

表3：ClarityChrom 软件计算水相普鲁兰多糖校准结果汇总

校准方程：Y= -0.0004468×X⁵+0.03375×X⁴-1.009×X³+14.91×X²-109.2×X+323.7

　　图 4 为四氢呋喃体系聚苯乙烯校准曲线，与水相校准方案一致，全部标样采用 5 次多项式拟合，标样偏差均低于 3%（表 4），相关系数同样接近 1，拟合效果优异，校准准确度高。

　　聚苯乙烯校准体系中，分子量最高的两组标样（A 刮片 6545000 道尔顿、B 刮片 2327000 道尔顿）超出单柱分离区间（表 1），不参与拟合；同时该色谱柱整体分离区间宽，低分子量标样组分分离难度大，仅选取每组瓶内分子量最高组分参与校准，因此原定 22 点校准缩减为 11 点，有效校准分子量区间 580–739500 道尔顿（图 4）。

　　若需优化低分子量组分分离效果，可更换窄分离区间色谱柱，例如 StyDiViBe-P-100Å 色谱柱，分离区间 100–10000 道尔顿，低分子量物质分辨率与检测精度显著提升。

图4：StyDiViBe-P-10E5A-BPT 色谱柱四氢呋喃体系11点聚苯乙烯校准曲线。绿色：A 刮片标样（6545000 Da、739500 Da、128900 Da、29460 Da、3320 Da）；紫色：B 刮片标样（2327000 Da、298600 Da、75050 Da、9310 Da、580 Da）；黑色瓶盖：66000 Da、15700 Da、4840 Da、1306 Da；蓝色瓶盖：42400 Da、8680 Da、3470 Da、474 Da；黄色瓶盖：25500 Da、6540 Da、2280 Da、266 Da；拟合函数：5 次多项式；相关系数 R²=0.999

表4：ClarityChrom 软件计算四氢呋喃相聚苯乙烯校准结果汇总

校准方程：Y=  -0.0005161×X⁵+0.02138×X⁴-0.363×X³+3.161×X²-14.49×X+34.16

　　·    校准曲线验证

　　采用已知分子量糖类样品验证普鲁兰多糖水相校准曲线；选取两组窄分布聚苯乙烯标准品验证聚苯乙烯有机相校准曲线。将两套校准曲线计算得出的分子量与标准品真实分子量对比，确认校准曲线准确度与可靠性。糖类、聚苯乙烯标准品对应的色谱图分别见图 5、图 6，并配套对应校准曲线。

图5：糖类样品色谱图（配套普鲁兰多糖水相校准曲线）。绿色：麦芽四糖；粉色：麦芽三糖；紫色：麦芽糖；橙色：葡萄糖；检测色谱柱：ABOA SuperOH-P-150 + ABOA SuperOH-P-350

图6：聚苯乙烯标准品色谱图（配套聚苯乙烯四氢呋喃校准曲线）。蓝色：聚苯乙烯 11600 Da；橙色：聚苯乙烯 336000 Da；检测色谱柱：StyDiViBe-P-10E5A-BPT

　　表 5、表 6 分别汇总糖类、聚苯乙烯标准品验证检测数据，包含真实分子量、校准曲线计算分子量、偏差百分比三项参数。

表5：水相普鲁兰多糖校准曲线验证 —— 糖类样品检测结果

表6：四氢呋喃相聚苯乙烯校准曲线验证 —— 聚苯乙烯标样检测结果

　　4. 结果与讨论

　　综合两张验证数据表结果：校准曲线计算分子量与标准品真实分子量高度接近；聚苯乙烯校准曲线整体偏差小于 4%，普鲁兰多糖校准曲线整体偏差小于 3%，可证实该分子量区间内两套校准曲线检测准确度达标。

　　若高分子量段检测偏差偏大，说明校准方案存在优化空间，优化途径如下：

　　·    在色谱柱有效分离区间内增加更多标准品，补充校准曲线拟合点；

　　·    引入流动相标记物，校正保留时间漂移带来的检测误差。

　　同时必须明确：只有待测样品化学结构与绘制校准曲线所用标准品匹配时，才能获得精准绝对分子量；若样品化学组成、分子结构与标准品差异较大，检测结果仅为相对分子量，数值存在误差。

　　举例：普鲁兰多糖校准标样与蛋白质样品化学结构完全不同，但二者流体力学直径相近，色谱中保留时间一致，最终软件输出的蛋白质分子量数值失真。根源在于校准曲线依托普鲁兰多糖建立，与蛋白分子结构不匹配。该现象充分说明，校准标准品选型需审慎，保障检测数据有效可靠。

　　通用校准法是优化检测的可行方案，可降低检测对特定标准品的依赖，拓宽凝胶渗透 / 尺寸排阻色谱适用样品范围。建立通用校准曲线，需要测定实验条件下标准品与待测样品对应的马克  -霍温克（Mark-Houwink）常数；常数可查阅文献获取，或搭配示差折光检测器、黏度检测器测定特性黏度自行计算。

　　5. 结论

　　依托KNAUER AZURA® GPC/SEC系统，可分别搭建强有机溶剂、水相两套分析校准体系；整套设备支持定制、模块升级，例如可加装额外检测器拓展检测功能。

　　若要保证检测结果重现性，色谱柱柱效（理论塔板数）必须达到国标规定的最低峰展宽限值，本实验所有色谱柱均依据 DIN EN ISO 官方标准完成性能检测并全部达标。水相普鲁兰多糖检测采用两根不同孔径色谱柱串联，拓宽分子量分离区间；四氢呋喃有机相聚苯乙烯检测采用单根宽分离区间专用色谱柱。

　　采用已知分子量标准品对两套校准曲线完成验证：糖类验证水相普鲁兰多糖校准，聚苯乙烯标样验证有机相聚苯乙烯校准。验证结果显示，聚苯乙烯校准曲线偏差低于 4%，普鲁兰多糖校准曲线偏差低于 3%，可确认对应分子量区间内校准曲线准确度可靠。

　　综上，实验人员严格遵循操作规范、把控各项关键影响因素，可大幅提升GPC/SEC检测结果的重现性与可靠性。

　　参考文献：

　　[1] DIN EN ISO 13885-3:2021-11, Gelpermeationschromatographie_(GPC)_ -Teil_3: Wasser als Elutionsmittel (ISO_13885-3:2020)； Deutsche Fassung EN_ISO_13885-3:2021. (2021).

　　[2] DIN EN ISO 13885-1:2021-11, Gelpermeationschromatographie_(GPC)_ -Teil_1: Tetrahydrofuran_(THF) als Elutionsmittel (ISO_13885-1:2020)； Deutsche Fassung EN_ISO_13885-1:2021. (2021).

　　[3] Radke, W. (2022). Tips & Tricks: Column Order in GPC/SEC. LCGC International. https://www.chromatographyonline.com/view/tips-tricks-column-order-in-gpc-sec (Last access: 26.02.2025)

　　[4] Kempf, B. (2010). Which GPC Column First?. LCGC International. https://www.chromatographyonline.com/view/which-gpc-column-first (Last access: 26.02.2025)

　　[5] Heinzmann, G., Heinzmann A., Heinzmann S. (2023). Die Universelle Kalibrierung in der Gelpermationschromatographie. Analytik NEWS. Das Labormagazin. https://analytik.news/fachartikel/2023/44.html (Last access: 26.02.2025)

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