本应用说明阐述了流速标记物（FM）可大幅提升凝胶渗透色谱 / 体积排阻色谱（GPC/SEC）分析的数据质量。开展三组水性 GPC/SEC 实验，模拟流速波动对测试结果的影响，并验证流速标记物削弱该类误差的效果。实验结果表明：不添加流速标记物时，流速波动会造成数据失真、结果失准；而搭配流速标记物并进行校正后，该类误差可显著降低。综上，使用流速标记物是提升 GPC/SEC 测试重现性与分子量测定准确度的关键手段。

　　1. 引言

　　凝胶渗透色谱/体积排阻色谱（GPC/SEC）是一种液相色谱技术，用于测定高分子分子量等关键参数。校准是 GPC/SEC 的核心环节，只有完成校准才能精准计算分子量。校准流程为：测定多种已知分子量校准标样的保留时间（也称洗脱体积），绘制描述分子量与洗脱体积对应关系的校准曲线（图 1）。

图1：典型 GPC/SEC 校准曲线：蓝色峰为本分离区间内分子量最小的待测物，红色峰为该区间分子量最大的待测物。

　　想要保证分子量测定准确，测试全程必须维持恒定流速。洗脱体积的微小波动，都可能造成分子量计算结果大幅偏差。流速标记物（Flow Marker，FM）可解决该问题，提升 GPC/SEC 结果的重现性与准确度。

　　流速标记物会在每张色谱图中生成专属参考峰（图 2），借此判断洗脱条件是否发生波动；基于标记物峰可计算校正系数，补偿流速变化带来的影响，保证不同批次测试的保留时间、洗脱体积具备可比性。该方法可实现精准校准、可靠测定分子量，最终大幅提升分析方法稳定性。

　　流速标记物选型原则

　　理论上任意物质均可作为流速标记物，但为获得最优效果，需满足以下条件：

　　·    分子量分布窄；

　　·    流体力学半径接近色谱柱排阻极限，避免与样品其他色谱峰重叠；

　　·    可溶于标样、样品所用的同一流动相溶剂。

　　常用流速标记物实例

　　·    水相体系：乙二醇；

　　·    有机相体系：乙苯、二叔丁基对甲酚（BHT）。

　　操作时，将标记物按合适浓度加入标样、样品溶液中，进样后色谱图会出现清晰独立的标记物特征峰（图 2）。

图2：多组添加流速标记物的色谱叠加图：黑色 = 乙二醇（流速标记物）；红色 = 麦芽四糖 + 流速标记物；蓝色 = 校准标样 +流速标记物；黄色标注区域 =流速标记物峰

　　2. 样品制备

　　葡聚糖校准：采用安捷伦 ReadyCal 成套标样，分子量覆盖 180～1450000 Da；标样溶于纯水，静置 1 小时保证完全溶解。

　　葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖：室温下纯水溶解过夜（不搅拌），配制成 2 mg/mL 溶液，经 0.45 μm 尼龙滤膜过滤备用。

　　所有测试统一选用乙二醇作为流速标记物，配制浓度 1.5 mg/mL。

　　3. 实验结果

　　3.1 软件

　　ClarityChrom® 色谱工作站搭载 GPC 扩展模块，内置流速标记物峰积分、识别专属功能，可自动识别流速变化并完成校正（图 3）。

图3：ClarityChrom® 工作站 GPC 扩展模块色谱窗口中流速标记物识别界面

　　在校准窗口的校准设置中，可开启流速校正功能，并录入流速标记物标准保留时间（图 4）。

图4：ClarityChrom® 工作站 GPC 扩展模块校准窗口流速校正功能设置界面

　　功能开启后，校准数据表、色谱结果表标题栏会分别标注 “FR Correction（流速校正）”“Flow Rate Correction（流速校正）” 以示区分（图 5）。

　　·    若流速标记物出峰时间稳定、无波动，校正系数恰好等于 1，无需对数据做任何修正；

　　·    标记物出峰提前：代表实际流速高于设定值。校准数据表中校正系数＞1，色谱结果表显示校正系数＜1；

　　·    标记物出峰延后：代表实际流速低于设定值。校准数据表中校正系数＜1，色谱结果表显示校正系数＞1。

图5：A：校准数据表 “流速标记物校正” 列；B：色谱结果表 “流速校正系数”

　　3.2 校正计算公式逻辑

　　标样校准阶段：通过流速校正系数（公式 1）对标样原始保留时间校正（公式 2），采用校正后保留时间（表格中标注 “RT Corrected”）生成校准曲线（图 6）。

图6：校准流程内流速校正运算逻辑

　　样品测试阶段：使用已建立的校准曲线解析添加流速标记物的样品谱图时，程序会根据单张谱图的流速校正系数调整整条校准曲线（公式 3）；基于校正后的标样保留时间，为每张色谱图生成专属校准曲线（公式 4）。

　　该机制可在流速波动的前提下，精准计算待测物真实分子量（图 7A）；若未使用流速标记物、或未识别标记物峰，程序不会自动调整校准曲线（图 7B），流速波动带来的误差无法消除，分子量计算结果严重失真（图 7B）。

图7：麦芽三糖（实测峰值分子量 Mp=504 Da）色谱图对比A：调用标准校准曲线 + 流速标记物流速校正，计算 Mp=534 Da；B：未识别流速标记物、无流速校正，计算 Mp=228109 Da

　　3.3 三组验证实验

　　设计三组对照实验，分别在启用 / 不启用流速标记物流速校正两种模式下测试（乙二醇为标记物），验证流速标记物补偿流速波动、提升 GPC/SEC 测试准确度与重现性的效果。

　　·    实验 A：流速波动对校准曲线的影响模拟

　　配制三组不同葡聚糖混合标样（深蓝盖、浅蓝盖、黄盖）用于绘制校准曲线；其中深蓝、浅蓝两组标样人为模拟流速波动：设定流速由 1 mL/min 提升至 1.2 mL/min。得到两组校准数据集：

　　·    校准曲线 A：启用流速校正；采用 5 阶多项式拟合，决定系数 R²=0.9995；

　　·    校准曲线 B：关闭流速校正；采用 3 阶多项式拟合，决定系数 R²=0.8918。

图8：校准曲线对比：蓝色 = 带流速校正的校准 A；橙色 = 无流速校正的校准 B。拟合模型选择标准：选取 R² 最高的回归方程，保证与实测数据匹配度最优

　　启用流速校正的测试 R² 高达 0.9995，说明校准模型与实测数据高度贴合，证明流速校正手段有效；未校正组 R² 仅 0.8918，模型拟合精度大幅下降。

　　进一步对比各校准点与对应曲线的百分偏差（图 9）：

　　·    蓝色柱（校正组 A）：各点偏差均值约 ±7%，准确度优异；

　　·    橙色柱（未校正组 B）：多处校准点偏差超 100%，尤以第 3、7、10 号标样偏差最为突出。

图9：1～11 号校准标样相对各自校准曲线的百分偏差柱状图：蓝色 = 校正组 A 偏差；橙色 = 未校正组 B 偏差

　　实验结论：不做流速校正会引入巨大数据偏差，直接降低校准曲线拟合度，充分证明流速标记物校正对精准测定分子量必不可少。

　　·    实验 B：校正算法准确度验证

　　固定标准流速 1 mL/min，另设 0.8 mL/min（泵流速偏低）、1.2 mL/min（泵流速偏高）两组流速模拟泵体故障；取同一混合标样（黄盖）添加流速标记物，在三种流速下分别进样，借助标记物对偏离流速下测得的保留时间进行校正。校正后保留时间与标准 1 mL/min 流速下原始保留时间高度吻合，校正后数据相对标准值偏差均小于 5%，证实该校正算法计算精度可靠。

表1：黄盖混合标样添加流速标记物，1 mL/min 标准流速下测得保留时间

表2：黄盖混合标样添加流速标记物，变流速测试后经校正的保留时间

　　实验 C：样品与校准流速不一致对分子量测定的影响

　　校准曲线 A 在 1 mL/min 流速下建立，人为将样品测试流速提升至 1.2 mL/min，测试四种已知分子量糖类，对比有无流速校正的分子量计算结果：流速提升 0.2 mL/min、无校正时，分子量计算结果严重偏高；使用流速标记物校正后，分子量计算偏差可控制在 10% 以内。

图10：四种糖类（麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖）峰值分子量 Mp 对数坐标图（Y 轴 log₁₀）。每组化合物三根柱状：灰色 = 真实 Mp；粉色 = 开启流速校正计算 Mp；绿色 = 关闭流速校正计算 Mp；虚线为计算值与真实值的百分偏差；紫色折线 = 校正组分子量偏差；绿色折线 = 未校正组分子量偏差。

　　以葡萄糖为例说明原理（图 11）：流速升高时，葡萄糖出峰提前；无流速校正时，提前的峰在校准曲线坐标中对应更小洗脱体积，系统误判为更大分子量，结果严重偏高。程序依据公式 3、4 结合流速标记物峰修正整条校准曲线，得到校正曲线 A2；校正后葡萄糖峰在校准曲线中回归正常坐标区间，即便样品与校准流速不一致，仍可准确计算分子量。

图11：含流速标记物的葡萄糖色谱图：绿色 = 无校正原始校准曲线 A1；蓝色 = 流速校正后校准曲线 A2。

　　4. 结论

　　整套系列实验证实：在GPC/SEC分析中引入流速标记物，可显著提升数据重现性与测定准确度。

　　·    标样测试阶段产生的流速波动，可通过流速标记物有效校正，获得可靠性更高的校准曲线；

　　·    在多种流速下对标样混合液测试，验证了校正算法的计算精度，流速标记物可有效补偿各类流速偏差；

　　·    样品测试流速与校准流速不匹配时，依托流速标记物校正可消除流速差异带来的误差，保证分子量测定精准。

　　综上，流速标记物操作简便、实用性强，是优化 GPC/SEC 数据质量的高效方案；实际应用中需注意三点：标记物可溶于流动相、检测器可检出标记物峰、标记物与样品组分无共流出、无相互作用。

表3：方法参数

表4： SEC系统配置

　　如您对AZURA®GPC/SEC系统和应用感兴趣，可关注绿绵科技官方微信公众号，或致电联系我们，以获取更多的信息和支持。