1. 引言

生物化工工艺的末端工序大多采用液相色谱（LC）完成目标产物纯化；同时，生产过程中也需要配套在线工艺监控，因此液相色谱技术已广泛应用于各类生物制造流程。

以串叶松香草茎秆为原料的生物发酵样品，除各类单糖、小分子糖类外，还含有不同聚合度的果聚糖。本研究采用体积排阻色谱（SEC）结合示差折光（RI）检测器，对样品开展定性表征，测定其分子量分布。实验选用聚乙二醇（PEG）标准品建立通用校正曲线，判定样品中分子是否处于果聚糖理论分子量区间。

随后将分析方法升级至半制备色谱规模，从低分子量糖类中分离富集低聚果聚糖组分；同时通过制备色谱实验，评估连续逆流液相色谱（模拟移动床色谱，SMB）工艺的可行性 —— 该工艺要求体系仅包含两组分，实现二元分离。

2. 样品前处理

• PEG 标准校正液配制：
  

  采用安捷伦窄分布 PEG 标准品套装，共 10 支标品，峰值分子量 Mp 分别为 106、194、410、610、1010、1450、3860、8160、16100、21160 Da；各标品以纯水配制成质量体积分数 0.1% 的标准溶液。

• 发酵样品处理：
  

  -20 ℃冷冻储存的发酵样品室温解冻；取 15 mL 样品，室温、10000 g 离心 30 min，弃沉淀，保留上清液；上清液经 0.45 μm 再生纤维素（RC）滤膜过滤。制备色谱直接使用滤液原液；分析色谱用纯水分别稀释 10 倍、20 倍、50 倍、100 倍备用。

3. 实验结果

3.1 校正曲线建立

实验成功搭建通用分子量校正曲线：采用 5 阶多项式函数对 10 组标准品测试数据拟合，判定系数 R²=0.99978；马克 - 豪温克（Mark-Houwink）参数取 K=10.4、α=0.57（见图 1）。

该校正体系可定量检测分子量 106 Da~21160 Da 区间内的物质。

色谱固定相选用 AppliChrom ABOA-SuperOH-P 填料，粒径 7 μm，孔径 250 Å，适配水相体系分离；该体积排阻填料最大可分离分子量 70000 Da 的物质。填料基质为亲水高分子，适用 pH 范围 2.5~12，耐压最高 80 bar，耐受温度 10~85 ℃。

样品前处理：稀释 20 倍，进样体积 50 μL；流速 1 mL/min、柱温 25 ℃条件下，可实现低聚果聚糖（峰 1）与低分子糖类（单糖、二糖、三糖，峰 2）的良好分离（见图 2）。

低聚果聚糖峰平均分子量测定值为 20247 Da；以果糖单体分子量 180.16 Da 计算，该果聚糖平均聚合度约 112。

3.2 方法放大至半制备规模

借助KNAUER的ScaleUp Converter 方法放大软件完成方法线性放大；色谱柱长度、填料粒径保持不变，仅扩大色谱柱内径（8 mm → 20 mm）并同步提升流速（1 mL/min → 7 mL/min）；因配套 50 mm 预柱存在，并非严格线性放大。

制备实验直接进样未稀释原液，进样量 200 μL，低聚果聚糖与低分子糖仍具备充足分离度（见图 3）。采用馏分收集器按 7.5 mL / 份自动分段收集，目标馏分再经分析色谱复检。馏分 F6、F7 为目标低聚果聚糖组分，其中 F6 纯度高于 F7；F8、F9 以小分子糖为主（见图 4）。

图3：半制备色谱柱（内径 20 mm）样品谱图，进样 200 μL，原液未稀释，流速 7 mL/min，柱温 25 ℃；1 - 果聚糖低聚物（聚合度约 112）；2 - 低分子量糖类

4. 结论

本研究采用体积排阻色谱（SEC）成功分离发酵样品中的低聚果聚糖与低分子糖类；该分析方法可实现糖类分子尺寸定性分析。示差折光检测器（RI）稳定性优异，可灵敏检出各类糖类信号。通用分子量校正体系通用性强，更换待测物与流动相后，仅需根据文献高分子手册或 ClarityChrom 软件推荐值调整马克 - 豪温克参数 K、α 即可重新校正；若选用流体力学半径与待测物更接近的标准品，分子量计算精度可进一步提升。依托KNAUER的 ScaleUp Converter 放大软件，可简便完成分析方法向半制备规模的工艺转化。

馏分收集结果证实：低聚果聚糖集中于 F6、F7 馏分，低分子糖类富集在 F8、F9 馏分，两类组分实现有效分离。半制备色谱下两组分分离度充足，满足模拟移动床（SMB）二元连续分离工艺开发需求。尽管相较于硅胶基质色谱，体积排阻色谱用于制备纯化存在上样量小、流速偏低等短板，但基于分子尺寸筛分的专一分离优势，使其完美适配本体系的分离需求。

附录：材料与实验方法

表1：分析型高效液相色谱方法参数

表2：分析型高效液相色谱系统配置

表 3 半制备高效液相色谱方法参数

表4：半制备高效液相色谱系统配置