本文系统探究了流速、填料粒径、流动相组成对色谱柱背压的影响规律，所得结论可为分析级方法开发提供实操指导，且可直接应用于规模化制备工艺。

1. 引言

色谱系统的背压由管路、色谱柱、流动相以及设定流速共同产生。每套色谱设备均存在最大耐压限值，因此压力监测是方法开发中不可或缺的环节，压力往往成为制约工艺可行性的核心限制因素。

色谱柱产生的背压与填料粒径、色谱柱柱长直接相关。标准工艺开发逻辑为：先在分析色谱条件下完成方法优化，再线性放大至制备规模。根据达西定律，理想线性放大过程中背压应保持不变，对应公式（ΔP 为背压，L 为柱长，dp 为填料粒径）：

制备型液相系统耐压上限普遍更低，因此工艺开发阶段必须控制色谱总背压，使其不超出后续制备设备的耐压范围。填料粒径越大，色谱柱产生的背压越低；但同等条件下，粒径增大会同步降低分离度。针对不同分离目标，需要在分离度与背压之间找到平衡；此外，大粒径填料采购成本显著更低，大规模纯化场景下该经济因素也需纳入考量。反相色谱常用流动相为水 - 乙腈、水 - 甲醇、水 - 乙醇混合体系。有机溶剂配比不同，体系背压差异巨大；可通过微调有机相比例或更换有机溶剂，实现背压降低。流动相本身带来的背压，在放大过程中基本无明显变化。本研究系统评估填料粒径、流速、流动相组成对背压的影响，并完成实际线性放大试验，对比分析级与制备级实测压力数据。

2. 分析型液相色谱背压测定

2.1 试验方案

采用KNUAER标准分析型HPLC系统开展第一组试验；4 根规格均为 150 mm × 4.6 mm 的 C18 色谱柱，填料粒径分别为 5 μm、10 μm、15 μm、20/45 μm；分别采用水 - 乙腈、水 - 乙醇、水 - 甲醇线性梯度（有机相 5%~100%）测试；同时设置该内径色谱柱常用 3 种流速：1.0 mL/min、1.2 mL/min、1.4 mL/min。实测总背压为色谱柱、管路及系统组件共同产生的压力总和。试验需先测定空柱管路系统背压，用总压扣除系统本底压力，方可得到色谱柱自身背压。每种条件下记录梯度过程中最高压力，并扣除系统本底压力用于后续分析。

2.2 水 - 乙腈梯度背压变化规律

所有测试条件下，水 - 乙腈梯度的压力曲线趋势高度一致：有机相比例升至 35% 前，压力基本平稳；达到 35% 乙腈时压力抵达峰值；随后持续下降，至 100% 乙腈时，压力约为峰值的一半（图 1a~c）。试验结果符合理论预期：最小粒径 5 μm 填料、1.4 mL/min 流速下背压最高；最大粒径 20/45 μm 填料、1.0 mL/min 流速下背压最低（图 1a、1c）。全程梯度下测定无色谱柱时的系统本底压力：1.4 mL/min 流速、15% 乙腈条件下系统最高背压约 16 bar（图 1d）；压力曲线走势与带色谱柱体系相近，25% 乙腈前压力维持平台区，之后持续下降（图 1d）。

图 1：不同粒径色谱柱在多种流速、水 - 乙腈梯度下的压力曲线；色谱柱规格 C18 150 × 4.6 mm

为直观对比各组最大背压，汇总各条件峰值压力（图 2），结合空柱系统压力数据可计算单根色谱柱在不同流速下的柱压。填料从 5 μm 更换为 10 μm 时，压力降幅最为显著（图 2）。

图2：不同粒径色谱柱、三种流速下水 - 乙腈梯度的最大背压；压力峰值出现在 31% 乙腈处；色谱柱规格 C18 150 × 4.6 mm

2.3 水 - 乙醇梯度背压变化规律

水 - 乙醇梯度的压力曲线与乙腈体系差异明显：有机相比例 5%~15% 区间压力小幅上升；持续提升至 55%~60% 乙醇时压力达到峰值；随后下降，终点压力略高于梯度起始压力（图 3a~c）。测定无色谱柱的系统本底压力：1.4 mL/min 流速、55% 乙醇条件下系统最高背压约 40 bar（图 3d）。

图3：不同粒径色谱柱在多种流速、水 - 乙醇梯度下的压力曲线；色谱柱规格 C18 150 × 4.6 mm

图4 汇总了三种流速下各色谱柱最大背压与空柱系统压力对比。

图4：不同粒径色谱柱、三种流速下水 - 乙醇梯度的最大背压；色谱柱压力峰值为61% 乙醇，空柱系统峰值为55% 乙醇；色谱柱规格 C18 150 × 4.6 mm

2.3 水 - 甲醇梯度背压变化规律

水 - 甲醇体系压力曲线走势与乙醇体系相近（图 5a~c）：5%~15% 甲醇区间压力小幅上升；持续升高至 55% 甲醇时达到峰值；随后持续下降，100% 甲醇下压力低于梯度初始值，该特征与乙醇体系不同。且全部测试条件下，甲醇体系背压均低于乙醇体系。无色谱柱系统压力曲线趋势匹配，峰值出现在约 50% 甲醇（原文笔误，应为甲醇）（图 5d）。

图5：不同粒径色谱柱在多种流速、水 - 甲醇梯度下的压力曲线；色谱柱规格 C18 150 × 4.6 mm图 6 汇总全部测试条件下最大背压对比。

图6：不同粒径色谱柱、三种流速下水 - 甲醇梯度的最大背压；色谱柱压力峰值为53% 甲醇，空柱系统峰值为46% 甲醇；色谱柱规格 C18 150 × 4.6 mm

3. 制备型色谱背压测定

仅扩大色谱柱内径、其余参数保持不变的理想线性放大工艺，色谱柱背压理论上保持不变。本试验完成线性放大：分析柱 C18 150 × 4.6 mm 10 μm，放大为制备柱 C18 150 × 50 mm 10 μm。分析基准流速 1.2 mL/min，按线性放大换算，50 mm 内径制备柱对应流速 141.78 mL/min；分别测定三种流动相梯度，同时采集空柱系统本底压力。水 - 乙腈梯度压力曲线趋势与分析柱一致（图 7a）：35% 乙腈前压力稳定，随后小幅下降；乙醇、甲醇梯度压力曲线走势同样与分析级匹配（图 7b、7c）。

图7：10 μm 填料、150 × 50 mm 制备 C18 色谱柱，流速 142.0 mL/min 下各溶剂梯度压力曲线；黑色 = 总压力，红色 = 系统本底压力，蓝色 = 色谱柱自身压力

扣除系统本底后，三种流动相色谱柱最大背压对比：60% 乙醇下压力最高，达 50 bar；34% 乙腈下压力最低，仅 24 bar（图 8）。

图8：10 μm 填料、150 × 50 mm 制备 C18 色谱柱，流速 142 mL/min 下，不同有机相比例对应的最大柱压

4. 分析与制备背压对比

对比 10 μm 填料、150 mm 柱长的 4.6 mm 内径分析柱与 50 mm 内径制备柱，验证线性放大背压不变的理论规律；制备流速 142 mL/min 对应分析基准流速 1.2 mL/min。扣除系统本底压力后，三种流动相下制备柱最大背压均略高于分析柱，差值约 4 bar（图 9）。

分析柱与制备柱的压力偏差来源推测：①装填工艺差异；②制备柱出入口接头为 1/16 英寸规格（分析柱为 1/8 英寸），1/16 英寸管路内径更小，146 mL/min 高流速下额外产生压力。整体压力变化趋势统一：乙醇体系背压最高，乙腈体系最低。

图9：线性放大后分析柱与制备柱最大背压对比

结论

本研究测试 4 根仅填料粒径不同的 C18 150 × 4.6 mm 色谱柱，在多种流速、流动相配比下的背压数据，结果符合理论预期：

• 全部测试条件下，5 μm 色谱柱背压最高，20/45 μm 色谱柱背压最低。乙醇、甲醇梯度压力曲线趋势相近，压力峰值均出现在有机相约 50% 处。

• 乙腈梯度曲线特征不同，峰值出现在有机相约 35%，之后压力持续下降。三种溶剂背压排序：乙醇＞甲醇＞乙腈。

• 分析色谱柱背压测定是制备方法开发的核心手段。理想线性放大过程中，色谱柱自身背压理论上保持恒定，可提前预判放大后工艺压力是否在制备设备耐压范围内。

附录：材料与实验方法

表1：AZURA 分析型高效液相色谱配置

表2：AZURA 制备型液相系统配置

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