近年来寡核苷酸治疗领域取得长足发展，市场对高纯度寡核苷酸原料的需求持续攀升。寡核苷酸经典生产路线为固相化学合成 + 色谱纯化；其中离子交换色谱凭借**载样量大、分离分辨率高、收率优异**的优势，是放大生产的理想方案。

　　本文展示德国 BianoGMP GmbH 公司的规模化纯化工艺成果。该企业专业研发、克级制备高纯寡核苷酸，面向科研开发与临床申报项目，拥有多年治疗性寡核苷酸 GMP 工艺开发、生产优化经验。本文采用离子交换色谱对寡聚脱氧胸苷（oligo dT）进行大规模纯化，最终实现纯度 95%、总收率 90% 的工艺指标。

　　1. 引言

　　过去二十年间，寡核苷酸既是基础科研核心工具，也是药物研发的核心前沿技术。以 siRNA、反义 DNA 为代表的基因沉默寡核苷酸已进入临床阶段；多款寡核苷酸药物（如帕替西兰 Patisiran）已获美国 FDA 批准上市 [1]。该类核酸药物疗效明确，毒理安全性表现优异。

　　药物开发阶段的核心难点在于 GMP 级原料制备、工艺放大与流程开发；其中原料药（API）纯化、分离合成副产物是生产关键环节。

　　色谱是制药行业广泛应用的生物分子分离技术，具备选择性强、适用范围广、易于规模化的特点。高效液相色谱（HPLC）主流纯化路线分为两种：离子对反相色谱（IP-RP）、离子交换色谱（IEX）。

　　离子对反相色谱依靠离子对试剂屏蔽核酸分子电荷，使其保留在普通反相色谱柱；但载样量极低，不适合放大生产 [2]。

　　离子交换色谱（IEX）载样与分离效率兼具，可直接从分析方法放大至制备级、商业化生产设备；洗脱体系以纯水相缓冲液为主：DNA 采用变性缓冲体系，RNA 采用非变性缓冲体系，相比离子对反相色谱所用有机试剂更加环保。色谱填料理化稳定性强，可实现高速、高通量分离，树脂再生、重装柱操作简便；其最突出优势是高载样量同时兼顾高分辨率与高收率。

　　本文采用离子交换色谱大规模纯化寡聚脱氧胸苷 oligo (dT)。oligo (dT) 可特异性结合 mRNA 的 polyA 尾，常用于 mRNA 分离提取、cDNA 合成引物，是分子实验通用工具核酸。

　　2. 实验部分：样品前处理与实验结果

　　寡核苷酸由BianoGMP公司完成固相合成并提供样品。固相合成完成后，氨水浸泡裂解树脂载体并脱除核酸保护基团；随后加入乙酸中和样品，降低体系电导率至 30 mS/cm 以下，提升核酸稳定性与水溶性；采用紫外分光光度法测定核酸浓度。 色谱纯化前，分析型 HPLC 检测（图 1）显示粗品核酸纯度仅 89.1%，工艺目标纯度为 95%。

图1：离子交换纯化前，合成粗品 oligo (dT) 分析色谱图

　　粗寡核苷酸采用制备型 HPLC 纯化，配套易用型 AZURA® 制备色谱系统。系统搭载三元制备泵，最高流速 220 mL/min，可精准搭建梯度洗脱程序；单通道紫外检测器实时监测洗脱过程，并联动分流阀触发馏分收集。因上样体积大，样品经由梯度泵第三通道进样。

　　离子交换树脂的核心优势为超高载样容量，同时维持高分离度与高产物收率，因此本实验选用强阴离子交换填料纯化核酸。缓冲液参数需根据寡核苷酸链长、修饰基团调整；本实验采用非变性磷酸盐缓冲液，溴化钠作为平衡反离子。 图 2 为梯度洗脱制备色谱图；为提升处理通量，实验采用高载样量，紫外吸收信号达到饱和。洗脱主峰手动分段收集，各馏分经分析色谱检测纯度；可外接自动馏分收集器 / 分流阀实现全自动收集。合并合格馏分后，分析型 HPLC 验证（图 3）核酸纯度达 95%，总收率 90%。

图2：1升寡核苷酸粗品制备纯化洗脱色谱图

图3：离子交换纯化、馏分合并后 oligo (dT) 分析色谱图

表1：合并后样品色谱峰积分表

　　3. 结论

　　寡核苷酸药物临床价值巨大，但规模化生产存在诸多工艺难点，亟需开发可放大的色谱纯化工艺。离子交换色谱分离效率高、操作简便、工艺稳定、放大兼容性强，是寡核苷酸纯化的优质方案。本研究完成寡聚脱氧胸苷 oligo (dT) 大规模离子交换纯化，最终实现 95% 纯度、90% 总收率的工艺效果。

图4：实验使用的 AZURA 制备型高效液相色谱系统

　　4. 材料与方法

表2： 整套制备系统配置

表3：制备色谱柱参数

表4：分析色谱柱参数

表5：制备色谱洗脱方法参数

　　参考文献

　　[1] Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nat Rev Neurol 14, 570 (2018).

　　https://doi.org/10.1038/s41582-018-0065-0

　　[2] Minkner, R., Boonyakida, J., Park, E. Y., & Wätzig, H. (2022). Oligonucleotide separation techniques for purification and analysis: What can we learn for today's tasks?. Electrophoresis, 43(23-24), 2402–2427.

　　https://doi.org/10.1002/elps.202200079