堆叠进样（Stacked injection）是提升制备型色谱生产效率的简便手段。该技术可在同一批运行流程中嵌套多次进样，最大化样品处理通量，缩短峰组分收集之间的系统空闲时间，同时节约运行时间与洗脱溶剂。馏分收集可实现自动化，操作简便、可靠性高。堆叠进样可最大限度压缩系统待机时间，提升整体纯化效率。该技术核心目标是在保证峰纯度的前提下，减少非洗脱阶段时间，更加充分利用色谱柱柱床分离能力。当目标物直接过载会造成杂质共洗脱时，堆叠进样也可作为替代方案；样品加载体积控制在仍可保证目标物足够分离度的水平。单次运行直接进样产量有限，而堆叠进样可在一次长周期运行内，完成多倍体积的样品进样。该方法对保留时间稳定性要求较高；方法开发完善后，进样循环几乎可以无限重复，实现半连续化纯化工艺，在不损失产物纯度的条件下自动处理大批量样品。

　　本文描述了使用自动进样器或样品泵进行堆叠进样，有效分离咖啡因和对乙酰氨基酚的方法。手动编写堆叠进样方法通常既耗时又复杂。PurityChrom® 6 软件包含一个堆叠进样功能，本应用说明将对此进行详细描述。它提供了一个用于动态方法编写的工具，使得调整循环时间和循环次数变得容易。

制备了浓度为 2 mg/mL 咖啡因和 12 mg/mL 对乙酰氨基酚的示例样品混合物，溶剂为 20/80 乙醇/水（v/v），并通过 0.45 µm RC膜（再生纤维素）过滤。

建立堆叠进样方法的工作流程

堆叠进样的一个要求是使用等度方法，并且所有峰都在相近的时间洗脱。理想情况下，进样和目标峰之间的时间段应不含杂质。因此，在目标峰之后长时间延迟洗脱的杂质会使堆叠进样变得困难甚至不可能。必须预先去除不与固定相相互作用而洗脱的基质化合物。

堆叠进样的硬件条件：需要自动进样系统（样品泵 + 自动进样阀，或全自动进样器），以及馏分收集系统。搭建堆叠进样方法共需要 5 个关键步骤，下文将详细说明。

单次进样运行：

　　首先，使用现有的等度方法进行一次单次测量（图 1）。进样体积和样品浓度应与后续堆叠进样过程所需的参数匹配。这是确定循环时间的基础。

图1：单次进样 500 µl 样品；(1) 对乙酰氨基酚；(2) 咖啡因

确定循环时间和进样持续时间：

循环时间定义了两次进样之间的时间间隔。应实现基线分离（分辨率 > 1.7）。为了找到合适的循环时间，可以在比较覆盖模式下打开单次进样测量色谱图和同一色谱图的副本。然后移动副本，直到原始色谱图的最后一个峰与副本色谱图的第一个峰不再重叠。

第二个色谱图的时间偏移量即为循环时间（见图 2）。进样持续时间显示在测量的色谱图中。它取决于所选的进样体积。为了节省时间和溶剂，自动进样器设置为仅在样品瓶之间进行清洗。

图2：循环时间的确定准备堆叠进样方法：

　　在运行初始的单次进样方法后，软件提供了一种动态方法来调整为堆叠进样。需要将单次进样方法拆分为 5 个步骤。为此，在方法过程中添加更多步骤。这些步骤是：平衡、准备进样、进样、分离和结束。调整后，用户只需指定所需的进样次数，方法会自动调整运行时间和进样时间。

① 平衡 Conditioning：

"平衡"步骤是一个命令步骤，用于为即将开始的运行准备系统。一旦序列被加载，它就立即启动。通常，系统主泵被激活，设置溶剂组成，设置检测器波长和数据采集速率，并执行自动归零。初始化进样设备。如果是自动进样器，则选择进样模式（图 3A）。如果是自动阀，则将其切换到装载位置（图 3B）。

图3： “平衡”设置；A：自动进样器；B：样品泵

② 准备进样 Prepare Injection：

"准备进样"步骤确保在下一次进样触发之前，样品已被加载。对于自动进样器，这是一个带有命令"自动进样器采样模块准备进样"以及等待条件"自动进样器采样模块状态 = 就绪"的命令步骤。一旦样品体积被吸入并加载到定量环中，自动进样器将报告就绪状态，并继续执行下一步骤（图 4A）。

在使用样品泵加载的情况下，"准备进样"步骤需要是一个时间表而不是命令步骤。进样阀切换到装载位置，启动样品泵并以合适的流速和持续时间运行，以充分加载样品环体积。之后，停止样品泵（图 4B）。

图4：准备进样设置；A：自动进样器；B：样品泵

③ 进样 Injection：

在"进样"命令步骤中，将样品引入系统。自动进样器阀或进样阀切换到进样位置（图 5A）。对于自动进样器，添加一个等待条件——"自动进样器采样模块状态 = 已进样"。这确保了在分离继续之前，全部样品体积都被引入（图 5B）。

图5：进样设置；A：自动进样器；B：样品泵

④ 分离 Separation：

"分离"步骤包含了源自单次运行方法的时间表中的所有剩余功能。在此处，启动和结束色谱图，并编程馏分收集。馏分收集有几种可能的选项。要将每个峰收集到其自己的容器中，可以使用紫外信号的阈值。超过阈值的动作会将馏分收集阀切换到收集位置。低于阈值的动作会将馏分收集阀切换回废液位置，并将收集器移动到下一个位置。如果目标物质应立即合并到同一个容器中，可以使用峰窗口功能。每个峰都有自己的峰窗口，其中指定了收集器位置。"分离"时间表是根据堆叠进样次数动态延长的步骤。

图6：分离设置

⑤ 结束 Finish：

　　最后，"结束"步骤用于结束运行。它是一个简短的时间表，通常会停止所有设备。它在最后一个分离步骤结束后立即运行。

图7：结束设置

准备堆叠进样序列

　　编写好堆叠进样方法后，创建一个新的序列文件。在序列工具栏中，激活"堆叠进样"以访问堆叠进样设置（图 8）。在序列表中创建新行，指明先前创建的堆叠进样方法。输入所需的进样次数。为样品指定样品 ID。对于自动进样器进样，还需输入所需的样品体积。在堆叠进样设置中，输入先前确定的循环时间。"进样前加载"时间用于说明何时应加载新的样品体积。需要根据所选进样设备加载所需样品体积所需的时间进行调整。"准备步骤"、"上样步骤"、"进样步骤"、"循环步骤"和"结束步骤"通过下拉菜单与方法中的相应步骤匹配。

图8：序列设置

运行堆叠进样：

最后，从纯化窗口启动序列。条件化步骤立即开始。按下启动按钮后，堆叠进样运行将自动执行。

图9：5次堆叠进样，(1) 对乙酰氨基酚，(2) 咖啡因

实验结果：

单次进样显示出对乙酰氨基酚和咖啡因的良好分离。确定了 3 分钟的循环时间。测量了一个包含 5 次堆叠进样的序列。所有峰仍显示基线分离。比较单次运行和堆叠进样所需的时间，在此示例中，样品通量提高了 40%，这意味着流动相使用量也相应地减少了 40%。在完成 3 次单次运行所需的时间内，执行了 5 次堆叠进样（见图 10）。

图10：单次进样与堆叠进样的时间比较

实例证明，借助 PurityChrom®6 色谱软件，堆叠进样纯化方法的开发与落地简单易行。循环周期确定后，软件可自动计算每一次进样的触发时刻。结合自动化馏分收集与溶剂回收功能，整套工艺可实现高度自主运行。即使难度较高的馏分收集任务，也可以通过阈值 + 时间窗口组合功能实现自动化。

堆叠进样能够高效处理大体积样品，且不牺牲产物纯度。相比于多批次单次进样，整体运行时长大幅缩短：堆叠进样模式下，第一批样品出峰前的等待间隙，就可以执行下一次进样。因此即便不启用溶剂回收，依旧可以节约时间与洗脱溶剂。

表1 ：带自动进样器的半制备系统

表2 使用泵进样的半制备系统