蜜蜂健康衰退、蜂群大量损失，是全球农业生态绕不开的棘手问题。加拿大的数据显示，2007‑2025 年间虽然养蜂人不断更替受损蜂群，使得蜂群总数量上涨 45%，但2024‑2025 蜂群越冬损失率，明显高于过去多年的平均水平。

　　蜂群死亡是多重胁迫叠加的结果：寄生虫侵染、病害、食物短缺、气候变化，再加上农药化学暴露。蜜蜂自身解毒代谢能力弱，农药及其在体内生成的转化产物，是威胁蜜蜂生存的重要风险因子。

　　但实际案件调查中，却经常遭遇困境。传统靶向检测只能检测预先设定好的一批农药。很多蜜蜂中毒样本里，检出农药的浓度远低于半致死剂量 LD₅₀，无法证明农药是致死元凶。农药代谢转化产物、农药助剂等不在检测列表中的物质，直接被完全忽略。

　　有综述统计 2011‑2021 年，覆盖 19 个国家的 50 篇蜜蜂农药残留相关研究，仅仅只有 1 篇使用了非靶向分析手段。只检测已知目标物，潜藏的有毒物质就会成为 “漏网之鱼”。

　　发表在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》的这项研究，搭建了一套跨不同高分辨质谱平台的可疑物筛查完整工作流程，专门用于蜜蜂样本中农药及其转化产物的识别，为蜜蜂不明原因中毒事件的溯源提供新方案，其中MassWorks 软件成为提升鉴定可靠性的关键一环。

　　完整分析流程：前处理 + 多层级数据解析

　　1. 改良 QuEChERS 样品前处理

　　蜜蜂样本冻干、均质，采用乙腈‑水体系萃取，对比 4 种 dSPE 净化方案，筛选最优净化条件。

图1：26 种代表性化合物的回收率 (a) 与基质效应 (b)，A：PSA+C₁₈+MgSO₄；B：Z‑Sep+C₁₈+MgSO₄；C：PSA+Z‑Sep+C₁₈+MgSO₄；D：无净化。化合物按 LogP 由高到低排序，虚线为合格阈值

　　从图 1 结果可以看出： 无净化组（D）基质抑制最为严重；综合回收率、基质效应两项指标，方案 A（PSA+C₁₈+ 无水 MgSO₄）综合表现最优，全部化合物回收率＞50%，26 种物质中有 20 种基质效应控制在‑20%~20% 区间。该方案对 LogP 介于 0.1‑5.3 的母体农药，以及极性更强的农药转化产物，都可以实现稳定回收；最终定容至 300 μL，在提升检测灵敏度的同时，不会过度放大基质干扰。

　　整个方法在三台完全不同的高分辨质谱设备上开展验证：布鲁克 LC‑QqToF、赛默飞 LC‑Q‑Orbitrap、沃特世 LC‑cIMS‑MS。70 种验证化合物（54 种农药 + 16 种转化产物）加标空白蜜蜂样品，加标水平贴合真实环境暴露：每只蜜蜂 10‑100 ng。

　　2. 三级递进式数据解析，层层过滤假阳性

　　整套工作流采用MZmine 初筛 → MassWorks谱图准确度→ SPS 二级质谱确证的多层策略。

• 　　MZmine（精确质量初筛）

　　依托 MS¹ 一级精确质量，批量检索可疑数据库，快速输出候选特征峰。三台仪器 100ng/bee 加标样本性能见下表：

　　表1：MZmine 精确质量筛查性能指标（100 ng 每只蜜蜂）

　　MZmine 优势是灵敏度高，三台仪器真阳性率全部≥80%；局限是仅依靠分子量，容易受基质干扰、同质异位素干扰，假阳性较多，仅能达到 Schymanski 鉴定置信等级 5（仅精确质量）。

• 　　MassWorks 软件光谱准确度校验（关键过滤步骤）

　　在真实蜜蜂样本分析时，研究引入 MassWorks 5.0 开展分子分子式可靠性筛选。 允许元素范围限定 C、H、N、O、P、S、Cl、F，设置 5 ppm 质量容差，双键等价 DBE 范围‑1~50，采用 sCLIPS 搜索模式。只有谱图准确度＞95% 的特征峰才予以保留，光谱准确度低于 95% 直接判定为假阳性剔除。

　　这一步相当于 “二道过滤网”，对 MZmine 输出的大量候选信号做分子式合理性核验，把一批由基质噪声、干扰峰产生的错误候选直接筛除，经过 MassWorks 筛选后的物质，鉴定置信度可以提升到 Schymanski Level4（确定分子式），大幅减少进入下一步 SPS 解析的无效数据。

• 　　SPS 相似分区筛查（MS² 二级质谱确证）

　　SPS 不依赖传统自建谱库，依托 PubChem 超过 24 万化合物数据库，通过分子数学拆分、碎片组合匹配，对经过 MassWorks 筛选后的候选物，利用二级质谱碎片开展进一步解析。

　　表2：SPS 基于 MS² 的可疑物注释性能指标（100 ng 每只蜜蜂）

　　SPS 优势是假阳性极低，三台仪器最大假阳性仅 9 个，部分条件下精确度可达 94.3%，鉴定置信等级可达 Level3（推定结构）；短板是高度依赖二级碎片质量，碎片信息不足时会产生假阴性。

图2：不同仪器获取的二级质谱对比。(a) 嘧霉胺，LC‑QqToF 碎片少无法被 SPS 识别，LC‑Q‑Orbitrap 碎片丰富，SPS 打分 54，成功识别；(b) 烯吗素，不同仪器碎片谱图存在明显差异，SPS 打分分别为 44 和 75

　　MZmine 广撒网捞取全部潜在信号；MassWorks 做分子式与谱图准确度把关，砍掉大量假阳性干扰；SPS 利用二级碎片进一步提升结构推定可信度。三层联合，兼顾检出广度与鉴定可靠性。

　　3. 实际染毒蜜蜂样本测试：成功捕捉体内代谢产物

　　实验对蜜蜂饲喂添加阿特拉津的蔗糖糖浆，设置两组：

• 　　即刻暴露组：喂食后立刻低温冷冻保存

• 　　48 h 孵育组：喂食后饲养 48 小时再取样

　　MZmine 处理后，即刻组得到 129 个特征峰，48h 组得到 193 个特征峰；经过峰形、保留时间、质量偏差初步过滤，再通过MassWorks 谱图准确度筛选： 即刻组仅保留阿特拉津一个有效阳性信号； 48h 孵育组检出阿特拉津，同时检出两种体内转化产物：去乙基阿特拉津、去异丙基阿特拉津。三者谱图准确度全部＞95%。

　　表3 ：阿特拉津及其转化产物鉴定指标

　　后续 SPS 的 MS² 解析进一步确认上述物质存在，再与标准品二级谱图比对。

图3：蜜蜂样本中检出的阿特拉津 (a)、去乙基阿特拉津 (b)、去异丙基阿特拉津 (c) 二级质谱图。黑色为蜜蜂实测谱图，粉色为标准品谱图

　　终鉴定置信度达到 Schymanski 最高 Level 1。

　　这个结果解释了很多中毒调查的困境：母体农药进入蜜蜂体内会快速代谢降解。取样时母体农药浓度已经很低，但转化产物仍然留存体内，可能参与毒性作用。只检测母体农药，完全会忽视代谢产物带来的暴露风险，MassWorks 的谱图准确度校验，保证了代谢物识别的可靠性，避免把基质干扰误判成代谢物。

　　4. 小结

　　这项研究告诉我们：评价农药对蜜蜂的化学暴露，不能只盯着农药原药，必须重视生物体内产生的转化产物。检测手段也不能局限于预设的靶向清单。

　　MZmine‑MassWorks‑SPS 三级处理的工作流，给蜂中毒事件调查提供了完整新思路。MassWorks 的谱图准确度校验填补了初筛与二级解析之间的质控缺口，让复杂生物基质中非靶向筛查的结果更加可信。未来，这套跨平台方案可以作为传统靶向检测强有力补充，帮助我们找到那些看不见的化学威胁。