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ISOLUTE®SLE+96孔板萃取全血维生素A、β-胡萝卜素和维生素E,用LC-APCI-MS-MS分析

关键词:ISOLUTE®SLE、96孔板、萃取、全血、维生素A、β-胡萝卜素、维生素E、APCI、LC-MS-MS、分析
时间:2016-12-12 15:50:16

这是一个使用ISOLUTE® SLE+ 柱和固定孔板萃取人全血视网醇(维生素A)、β-胡萝卜素(维生素A前体)和α-生育酚(维生素E)的方法。 

 (维生素A、β-胡萝卜素和维生素E)

维生素A和E对于哺乳动物和生物系统具有抗氧化性和抗炎作用,防止细胞突变和组织损伤。由于基质效应LC-MS-MS分析之前需要萃取全血的维生素A和E。本方法是一种快速、高通量的样品制备技术,可以消除全血的基质干扰,可以在200纳克/毫升或更少的目标分析物的质谱检测。
固相支撑萃取(ISOLUTE SLE +)板和柱提供了可以替代传统的液-液萃取(LLE),适合生物样品的制备,不会形成乳状液并显著降低样品制备时间。

分析物:全血视网醇、β-胡萝卜素、α-生育酚
ISOLUTE SLE+ 配置
ISOLUTE® SLE+ 400µL 固定孔板,货号820-0400-P01

ISOLUTE SLE+ 步骤
样品预处理:用10uL异丙醇和70uLHPLC级水稀释50uL全血,加内标到混合液,轻轻涡旋溶液。
上样:装载预处理过的样品(约130uL)到柱板,施加正压(PRESSURE+ 96 正压歧管PPM-96)或低真空(VacMaster-96 样品处理歧管121-9600)打开流量,让样品在重力作用5分钟。
萃取分析物:900uL正己烷:异丙醇(v/v,90:10)加到每个孔,然后再使用900uL正己烷:异丙醇(v/v,90:10)。在收集的过程,如有需要,使用正压或打开低真空。
后萃取处理:样品蒸发至干(SPE Dry 96孔,货号:SD-9600-DHS-NA),并用流动相稀释到200uL。
样品制备注意:预处理血清样本时,加入的异丙醇会加速破坏蛋白结合和增加分析物整体溶解度。
样品通量:3.2小时或更少的时间,就可全部完成一个96孔板处理,LC-MS-MS5分钟分析一个样品,96孔板的整个运行时间为480分钟(8小时)。超过24小时样品通量将达到每天处理288个样品(预处理和质谱分析)。

HPLC的条件
仪器:Agilent 1200 Liquid Handling System
色谱柱:Biotage Resolux 120 C8, 4.5µm 分析柱(150 x 3.0 mm id) (Biotage, Lund, Sweden).
流动相:甲醇
等压:起始100%甲醇容积流速0.8mL/min5分钟
进样体积:20uL
质谱仪器
仪器:Applied Biosystems/MDS Sciex 4000 Q-Trap三重四极杆质谱,APCI离子源

结果
ISOLUTE SLE+ 萃取板全血维生素A、β-胡萝卜素和维生素E,每种分析物在200ng/mL的平均回收率测定数据>95%。

(100ng/mL维生素A、β-胡萝卜素和维生素E甲醇溶液典型提取离子谱图)

(1ug/mL脂溶性维生素添加到全血,用400uL ISOLUTE SLE +固定板萃取最终浓度200ng/mL的典型提取离子谱图,箭头表示在相对高浓度内源性基质有异构体杂质)

(脂溶性维生素和每个目标分析物添加到全血,用400uL ISOLUTE SLE +固定板萃取最终浓度200ng/mL的典型单独的提取离子谱图)

(全血200ng/mL平均回收率血维生素A(112%)、β-胡萝卜素(125%)和维生素E(96%),回收率高是由于血液中存在内源性维生素)


订货信息
货号:820-0400-P01 ,ISOLUTE SLE+ 400 固相支撑液体萃取板,数量:1个
货号:PPM-96 ,PRESSURE+ 96 正压歧管96 ,数量:1个
货号:121-9600,VacMaster-96样品处理歧管(无真空控制),数量:1个
货号:SD-9600-DHS-NA:SPE Dry 96 ,110/120V,美式,数量:1个
货号:SD-9600-DHS-EU:SPE Dry 96 ,220/240V,欧式,数量:1个
货号:R1-1521-1085,Resolux 120 分析柱 C8 150 X 2.1 mm,4.5 µm ,数量:1个

本文译于:AN754 Extraction of Retinol, β-Carotene (Vitamin A) and α-Tocopherol (Vitamin E) from Whole Blood using ISOLUTE ® SLE+ 96-Well Plates with APCI-LC-MS-MS Analysis


视网醇(retinol)是维生素a的化学名称。 维生素a是最早发现的维生素﹐是一种脂溶性的维生素。视网醇只存在于动物体内﹐以肝脏含量最为丰富﹐鱼﹑蛋﹑奶﹑肉也多少含有些。

β-胡萝卜素;β,β-Carotene;Solatene  β-胡罗卜素(遮光剂,维生素A前体),纯净的产品为深红色或暗红色、有光泽的斜方六面体或结晶状粉末,对氧、热及光不稳定,是类胡萝卜素之一。它是自然界中存在最普遍、最稳定的天然色素,许多天然食物如螺旋藻、绿色蔬菜、甘薯、胡萝卜、菠菜、木瓜、芒果等,皆存有β-胡萝卜素。熔点183℃。溶于二硫化碳、苯、氯仿。0℃时在100ml己烷中可溶该品109mg,不溶于水、丙二醇、甘油,几乎不溶于甲醇和乙醇,对氧、热及光不稳定。

α-Tocopherol,α-生育酚,Tocopherol(抗氧化剂)/维生素E,是一种常用的天然抗氧化剂。可以保护细胞免受氧化应激导致的损伤。

临床意义
维生素是生物的生长和代谢所必需的微量有机物。分为脂溶性维生素和水溶性维生素两类。前者包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等,后者有B族维生素和维生素C。人和动物缺乏维生素时不能正常生长,并发生特异性病变,即所谓维生素缺乏症。
维生素检查可以了解机体中维生素的种类和总量,维生素缺乏可引起维生素缺乏症。因此维生素检查可以起到疾病诊断和预防的作用。 
异常结果:维生素A,视黄醇,不在0.5-2.1μmol/L范围。 
维生素E,生育酚,不在11.6-46.4μmol/L范围。
单神经病与神经丛神经病,小儿晚发性维生素K缺乏病,维生素B2缺乏病,维生素D中毒症,维生素B6依赖综合征,维生素A过多病,小儿维生素B12选择性吸收障碍综合征,小儿维生素B6缺乏病,小儿维生素B2缺乏病,小儿维生素A缺乏病。
紫斑,婴儿需要较大量的维生素B6,维生素E缺乏,维生素K缺乏,维生素B族缺乏,维生素B1缺乏,维生素D中毒,脂溶性维生素缺乏,小儿维生素D缺乏,维生素C缺乏。


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