本应用是ISOLUTE®  PLD+萃取血清中25-羟基维生素D，然后在LC-MS/MS上分析检测。

对于生化样品制备来说，ISOLUTE®PLD+除蛋白和磷脂板比传统的蛋白沉淀技术，ISOLUTE®PLD+大幅改了提取清洁度。本应用介绍了一种简单、有效的®ISOLUTE PLD+萃取血清中25-羟基维生素D的方法，萃取产物蛋白质和磷脂含量极低，具有高重现性的回收率。

分析目标物
25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和内标d6-羟基维生素D3

样品制备步骤
板子：ISOLUTE® PLD+除蛋白和磷脂板，货号：918-0050-P01

样品预处理
血清样品加入10uL内标（相当于30ng/m），混合，静止1小时左右发生结合反应

使用的溶剂
ISOLUTE® PLD+ 板的每个孔加入400uL乙腈（MeCN）

使用的样品
取100uL带有内标的血清，混合，重复抽吸/分配步骤。

洗脱目标物
正压3psi或-2bar真空下约5分钟，如果样品含有高颗粒物可以适当增加压力或真空条件。

萃取后处理
使用Biotage® SPE Dry (40 °C ，40 L/min)或TurboVap® (40°C ，1.0 bar). 空气或氮气气流吹干萃取液。

定容
用100uL30/70甲酸铵（2mM）100µl，0.1%甲酸水/甲醇定容。

UPLC的条件
仪器
Waters Acquity UPLC

色谱柱
ACE EXCEL 2 C18-PFP, 100 mm x 2.1 mm id 2 μm, (ACT, UK)

质谱的条件
Quattro Premier XE三重四极杆，ESI电喷雾离子源

结果
色谱图
三分钟完成25-羟基维生素D2和D3分析，如下图。

回收率
使用血清和处理过的血清，在不同浓度2-00ng/mL下测试，维生素D的高重现的回收率>70%。如下图。

PBS/BSA校正曲线
使用PBS/BSA，在不同浓度1-100ng/mL的校正曲线测定25-羟基维生素D2和D3，具有非常好的相关系数，r² > 0.99。

Chromsystems 校正曲线
使用已经校正的血清标准（采购自Chromsystems），在0-69ng/mL的浓度下，测定25-羟基维生素D2和D3，具有非常好的相关系数，r² > 0.99。

DEQAS外部质量评估方案
用优化的方法得到DEQAS 25-羟基维生素D结果
本方法后经5个DEQAS血清样品萃取测试，一起与Chromsystems校正因子进行优化。DEQAS标准至少80%的结果落在所有实验室修剪平均的+或-25%以内。

订货信息
货号：918-0050-P01 ，ISOLUTE® PLD+ 固定孔板 数量：1个

货号：121-9600 Biotage® VacMaterTM-96 样品处理歧管 数量：1个

货号：PPM-96，Biotage® PRESSURE+ 96 正压歧管，数量：1个

货号：SD-9600-DHS-EU，Biotage® SPE Dry样品浓缩系统220/240V 数量：1个

货号：C103264，TurboVap® 96样品蒸发仪220/240V 数量：1个

附Biotage® Extrahera^TM方法设置，更多配置方法见原文

维生素D（vitamin D ）

为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。目前认为维生素D也是一种类固醇激素，维生素D家族成员中重要的成员是VD2（麦角钙化醇）和VD3（胆钙化醇)。维生素D均为不同的维生素D原经紫外照射后的衍生物。植物不含维生素D，但维生素D原在动、植物体内都存在。维生素D是一种脂溶性维生素，有五种化合物，对健康关系较密切的是维生素D2和维生素D3。它们有以下三点特性：它存在于部分天然食物中；人体皮下储存有从胆固醇生成的7-脱氢胆固醇，受紫外线的照射后，可转变为维生素D3。适当的日光浴足以满足人体对维生素D的需要。

从食物中得来的维生素d，与脂肪一起吸收，吸收部位主要在空肠与回肠。胆汁帮助其吸收。脂肪吸收受干扰时，如慢性胰腺炎、脂肪痢及胆道阻塞都会影响他的吸收。吸收的维生素d与乳糜微粒相结合，由淋巴系统运输，但也可与维生素d运输蛋白（α-球蛋白部分）相结合在血浆中运输。有些与β-脂蛋白相结合，口服维生素d与乳糜微粒结合，比从皮肤中来的与蛋白结合者易于分解。当维生素d运到肝脏中，在微粒体中经单氧酶系统作用，将其25位羟基化形成25（oh）d(25-hydroxy vitamin d3)，肝外的其他组织也可吸取维生素d及25-（oh）d3，因此组织中维生素d及25（oh）d3及其总量比血浆中多，如果靶组织需要，可将其释放出来，他们在脂肪组织中多，释放速度慢，当体重减轻，脂肪减少时，他们也可释放出来。静脉注射维生素d，较快的由血浆进入到组织中。血浆中25（oh）d3在注射后1～3天达到高峰，其浓度可达到20～40ng·ml-1,高可达80 ng·ml-1。浓度与摄入量有一定的关系，小于4 ng·ml-1,临床上可发生佝偻病及骨质软化。25（oh）d3在肾线粒体单氧酶作用下（酶系统包括细胞色素p450、铁硫蛋白及黄素蛋白），经羧基化，转变为1，25-（OH）2-VD3(1,25-dihydroxy vitamin d),他是维生素d的生物作用形式，现将其作为激素。

临床意义
1．维生素D又称抗佝偻病维生素，是类固醇衍生物，属脂溶性维生素。维生素D主要包括维生素D2（又称麦角钙化醇）及维生素D3。其生物学作用主要包括①促进小肠钙吸收；②促进肾小管对钙、磷的重吸收；③调节血钙平衡；④对骨细胞呈现多种作用；⑤调节基团转录作用。
2．维生素D缺乏主要表现为骨质软化症（osteomalacia）、骨质疏松症（osteoporosis）及佝偻病等。前者常见于成人和孕产妇，后者多发生于儿童。①骨质软化症：成人（特别是孕妇、乳母）维生素D缺乏引起的骨质软化症，其临床表现为骨质软化，腰腿部骨疼痛、易变形等；②骨质疏松症：维生素D缺乏所致的骨质疏松症常见于老人，由于其肾功能降低，胃肠吸收欠佳，户外活动减少，影响骨钙化可发生自发性骨折。此外，维生素D缺乏也可引起肌肉痉挛、小腿抽搐等手足痉挛症的症状；③佝偻病：由于维生素D的缺乏，骨骼不能正常钙化，使骨骼变软，弯曲变形，患儿表现为烦躁、夜惊、多汗等，严重缺钙患儿可见肋骨与软肋骨衔接处有珠状突起，下肢呈“O”形或“X”形，胸骨外凸形成鸡胸等，由于钙磷代谢失调，患儿牙齿发育不良，易发生龋齿。
3．维生素D过多常由于过量摄入维生素D引起。其临床表现为疲劳、无力、食欲缺乏、恶心、呕吐、腹泻等，严重者可有生长发育迟缓、高热、脱水、癫痫发作等，可引起肾、脑、肺、胰腺等脏器有异位钙化灶和肾结石。

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