质谱法是鉴定未知化合物的重要手段。在有谱库辅助的前提下，我们可以通过谱库检索来快速确定目标物可能的几个疑似候选物，然后在标准品对照的情况下，通过保留时间信息、质谱图来对疑似物进行验证以确定真正的目标。在没有谱库时，就需要测定目标化合物的精确质量数，然后对可能的分子式进行预测（见图1），再通过二级或多级质谱的碎片信息来探索可能的结构。

　　图1： 精确质量数推导可能的元素组成（分子式）

　　虽然高分辨质谱在高质量精度下已经将精确质量数测定得尽可能准确，但是还是不足以帮助我们解决分子式的鉴定问题。因为当未知化合物的分子量很大时，匹配在测定精确质量误差范围内的可能元素组成数量也会增加；尽管高分辨质谱拥有极高的质量精度，但是仍然会存在很多不能排除的可能元素组成。Tobias Kind和Oliver Fiehn在2006年发表的一篇文章中，总结了在仅考虑C、H、N、O、S五种元素的情况，不同分子量大小的化合物在不同质量精度下的可能元素组成的个数，如图2所示，即使质量精度达到FT-MS的0.1 ppm以内，随着分子量的增大，元素组成的可能性越来越多。因此，仅靠质谱的高质量精度，往往并不能确定一个唯一的元素组成，尤其是当要考虑到更多的元素时。

　　图2： 不同质量精度下的元素组成个数

　　（数据来源：Tobias Kind and Oliver Fiehn, BMC Bioinformatics 2006, 7:234）

　　高分辨质谱上的同位素信息与分子式鉴定

　　质谱图上的信息，除了质量数外，还有同位素的丰度信息。Tobias Kind和Oliver Fiehn在2006年的文章中还证明了同位素比例结合精确质量数在减少可能的元素组成方面比单纯依靠更高的分辨率和质量精度更占优势。图3显示了C25H23N2OS+在0.1ppm质量精度下，共有7个可能的分子式，排除掉2个Na元素个数不对的分子式，仍然有5个分子式，对比这5个分子式的理论同位素轮廓分布，我们可以看到它们同位素轮廓分布存在显著差异（见图4），因此只要将理论的同位素轮廓与测试谱图的同位素轮廓进行比对，就能确定出真正的分子式。

　　图3：FT-MS在0.1ppm质量精度下得到的C25H23N2OS+可能分子式

　　（数据来源：Yongdong Wang and Ming Gu. Anal. Chem. 2010, 82, 7055–7062）

　　图4：五个候选分子式在A+1处的理论同位素轮廓分布（MS分辨率=80万）

　　（数据来源：Yongdong Wang and Ming Gu. Anal. Chem. 2010, 82, 7055–7062）

　　但实际的质谱谱图由于仪器本身等因素的影响，导致实验谱图的峰型发生了变形，从而会使得同位素轮廓的比对会产生5%以上的谱图误差，这对于区分一些同位素丰度比差异接近的分子式并不容易。在MassWorks软件中，不只是简单地将实验谱图和理论谱图进行对比，而是用独特的峰形校正技术去除噪音等畸变因素，以得到跟理论谱图一样的对称分布的轮廓曲线。用这种校正谱图跟理论谱图做对比，可以将同位素分布的谱图误差缩小至2%以内，进一步提升利用同位素轮廓区分分子式差异的准确度。如图5所示，m/z=844.5067的化合物在TOF仪器上，在4ppp的质量精度下共有75个可能的分子式，尽管排名第一的分子式的质量误差并不是最小的，但是它的校正谱图和理论谱图的同位素谱图准确度（Spectral Accuracy）最佳，证明了该分子式为正确的分子式；而排名第2的分子式可以明显观察到由于S元素的影响使得理论谱图比样品的校正谱图在A+2处的丰度要高，谱图的误差为2.6%左右。

　　John C. L. Erve在2009年和2011年发表的文章中，分别验证了在LTQ/Orbitrap和Q-TOF上利用MassWorks的峰形校正技术确定分子式的优越性，尤其是在Orbitrap上，分子量大于900的化合物，谱图准确度可以帮助消除99%以上的分子式。

　　图5：TOF在4ppm误差内，Top 2分子式的理论谱图和校正谱图的谱图准确度对比

　　高分辨质谱可以通过精确质量数据和同位素分布信息来确定未知化合物的分子式，那么低分辨质谱，如四极杆质谱，是不是也可以这样做呢？

　　可以！

　　四极杆质谱上的分子式测定

　　MassWorks软件的TrueCal™校正技术可以将四极杆质谱的质量精度提高100倍以上，从而使其获得精确质量数的测定能力，再借助CLIPs技术就能准确测定未知化合物的元素组成，这一技术已经在数千个客户处得到了验证。

　　四极杆质谱的分辨率尽管不如高分辨质谱，但是它测定同位素丰度的稳定性是优于高分辨质谱的，而且更宽的线性范围，可以保证高、低丰度的同位素都能被准确检测。图4中的高度分离的不同元素的同位素，在四极杆质谱上表现为这几个元素的叠加，我们依然能清晰的区分出这5个分子式的同位素轮廓分布的差异，因此，在四极杆质谱上通过精确质量数结合同位素分布一样能鉴定出未知物的分子式。

　　图6：五个候选分子式在四极杆质谱上的理论同位素轮廓分布（MS分辨率=800）

　　（数据来源：Yongdong Wang and Ming Gu. Anal. Chem. 2010, 82, 7055–7062）

　　图7（上）显示GC/MS测定的m/z=164的化合物，在10mDa的误差内，共有6个分子式，但它们的同位素分布的谱图准确度存在明显差异，图7（下）清晰显示了前3个分子式的理论同位素与实测校正谱图的对比，结果表明正确的分子式即为第一个分子式C10H12O2。

　　图7：GC/MS上测定精确质量数和分子式

　　（数据来源：Wei Zhou and Yaheng Zhang,Rapid Commun. Mass Spectrom. 2011, 25, 3097–3102）

　　关于MassWorks 软件

　　MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　关于绿绵科技

　　绿绵科技是Cerno Bioscience公司在中国区的总代理商，负责Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等产品市场推广、销售、售前/售后技术支持、应用支持。

　　若您想了解获取 MassWorks 产品的更多信息或应用，欢迎致电绿绵科技！